法桐花粉主要過(guò)敏原基因Pla a1重組表達(dá)及鑒定①

王貴佐 陶愛林 孫秀珍 李滿祥 劉 昀 鄒澤紅 吳媛媛

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸病研究室，西安710004)

法國(guó)梧桐為懸鈴木科、懸鈴木屬，在各地廣泛種植。Kosisky等［1］在1998～2007采用定量收集法對(duì)華盛頓市區(qū)進(jìn)行了10年的氣傳花粉變應(yīng)原調(diào)查，結(jié)果顯示主要的花粉類型包括:櫟樹、柏樹、松科、桑屬、樺科、槭屬、懸鈴木屬、梣屬、禾本科，全年花粉總量中樹花粉所占比例為91．2%，草類占7%。Aira等［2］對(duì)西班牙西北部Iberian Peninsula地區(qū)的主要綠化植物進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸鈴木屬、齊墩果屬是當(dāng)?shù)刈钪饕幕ǚ蹃?lái)源。Ture等［3］報(bào)道了土耳其Bilecik地區(qū)氣傳花粉的研究，發(fā)現(xiàn)松屬、柏科、懸鈴木屬、櫟屬、柳屬是該地區(qū)的主要?dú)鈧骰ǚ郏⑶铱諝庵谢ǚ蹪舛茸罡咴?月。Celenk等［4］在土耳其西北部的Bursa地區(qū)進(jìn)行了氣傳花粉調(diào)查，發(fā)現(xiàn)松屬、齊墩果屬、懸鈴木屬、柏屬、櫟屬、禾本科、蕁麻科、栗屬在空氣花粉的播散中起主要作用，5月空氣中花粉的濃度達(dá)到最高。法桐花粉不僅顯示了較高的空氣飄逸濃度，并且各地研究者發(fā)現(xiàn)法桐花粉可引起廣泛的變態(tài)反應(yīng)。劉光輝等［5］通過(guò)對(duì)湖北省氣傳花粉的調(diào)查并對(duì)2 300例花粉癥患者進(jìn)行皮膚過(guò)敏原檢測(cè)試驗(yàn)及對(duì)發(fā)病季節(jié)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湖北省陽(yáng)性率最高的春季致敏花粉主要為懸鈴木屬，秋季致敏花粉主要為篙屬、豚草屬。盧家美等［6］通過(guò)對(duì)花粉的曝片采集及對(duì)168名過(guò)敏性哮喘患者進(jìn)行花粉血液變應(yīng)原篩查，得出艾蒿、法桐、藜草、葎草、禾本科可能是西安市的主要致敏花粉。Lauer等［7］發(fā)現(xiàn)在地中海地區(qū)法桐花粉變應(yīng)原IgE反應(yīng)率27．3% ～63．8%，是該地區(qū)的主要?dú)鈧骰ǚ圩儜?yīng)原。越來(lái)越多的調(diào)查資料及臨床流行病學(xué)資料表明，法國(guó)梧桐花粉是我國(guó)及西方多數(shù)國(guó)家地區(qū)花粉癥的重要原因。

目前發(fā)現(xiàn)法桐變應(yīng)原提取液中主要有以下主要致敏蛋白:Pla a1、Pla a2、Pla a3。Pla a1蛋白可與92%以上的法桐花粉癥患者血清發(fā)生反應(yīng)，而Pla a2、Pla a3 反應(yīng)率分別為 84% 和 63．8%［7-9］。目前對(duì)法國(guó)梧桐花粉主要變應(yīng)原的表達(dá)、純化卻鮮有研究，并且對(duì)Pla a1蛋白進(jìn)行表達(dá)純化具有很主要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究對(duì)Pla a1蛋白首次進(jìn)行了表達(dá)、純化和鑒定，為制備高純度變應(yīng)原、重組低致敏過(guò)敏原及變應(yīng)原核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)試劑:T4 DNA連接酶、pET-44a表達(dá)載體購(gòu)自 Promega公司;宿主大腸桿菌JM109、表達(dá)宿主大腸桿菌Rosetta購(gòu)自Novagen公司;DNA合成和測(cè)序由上海博尚生物公司完成;rTaq 聚合酶、10 ×PCR buffer、dNTP Mixture、IPTG 及DL2000 DNA marker等購(gòu)自大連寶生物工程公司;瓊脂糖、蛋白胨、酵母以及SYBR Green熒光染料等購(gòu)自基因公司;PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;PVDF膜購(gòu)于Millipore公司;預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Bio-Rad公司;脫脂奶粉購(gòu)自Sigma公司;StrepTrapTMHP 1 ml柱子購(gòu)自 GE公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 密碼子優(yōu)化及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)其在Gen-Bank中的ID號(hào)AJ427413．2獲得其核苷酸和氨基酸序列，確定開放閱讀框?yàn)?56個(gè)氨基酸，468堿基對(duì)，引入NdeⅠ、PstⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)及 Strep TagⅡ。根據(jù)原核表達(dá)載體大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛性，同時(shí)考慮RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高翻譯起始效率，利用DNAStar軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化完成后GC含量由44．3%變?yōu)?7．6%。優(yōu)化后的全基因序列由上海博尚生物有限公司合成。

1．2．2 Pla a1基因表達(dá)載體的構(gòu)建 Pla a1基因優(yōu)化后的全編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物由上海博尚生物有限公司合成。上游引物為5'-CT-，下游引物 5'-GCCTGCAGAGCACCAAGCAGTTT-3'，上下游引物退火溫度分別為:68．2℃和69．1℃，黑體下劃線部分分別為NdeⅠ、PstⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5分鐘;95℃變性30秒，63．3℃退火30秒(1℃/touchdown/cycle)，72℃延伸30秒，7個(gè)循環(huán);95℃變性30秒，57．3℃退火30秒，72℃延伸30秒25個(gè)循環(huán);72℃延伸5分鐘。對(duì)基因公司合成后甘油菌TOP10-Puc57-Pla a1行單克隆菌落PCR，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR結(jié)果。對(duì)鑒定陽(yáng)性單克隆菌落搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，NdeⅠ和PstⅠ雙酶切，同時(shí)對(duì)改造過(guò)的pET44a質(zhì)粒載體(載體上含有Strep TagⅡ)NdeⅠ和PstⅠ雙酶切位點(diǎn)，獲得相同粘性末端，2%的瓊脂糖凝膠電泳分別進(jìn)行目的片段Pla a1及載體pET-44a回收;并進(jìn)行連接反應(yīng)，目的片段與載體之比為3，T4 DNA連接酶于4℃連接16小時(shí)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET44a-Pla a1;將連接產(chǎn)物經(jīng)KCM(0．5 mol/L KCl，0．15 mol/L CaCl2，0．25 mol/L MgCl2)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)JM109;通過(guò)氨芐青霉素Amp抗性LB平板篩選，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性單克隆過(guò)夜培養(yǎng)菌液送上海博尚生物有限公司測(cè)序;選取測(cè)序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株感受態(tài)Rosetta，氨芐青霉素Amp抗性LB平板篩選，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性單克隆過(guò)夜培養(yǎng)菌液送測(cè)序，選取測(cè)序正確的單克隆菌落誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1．2．3 Pla a1蛋白表達(dá)及鑒定 挑取測(cè)序陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET44a-Pla a1的E．coli Rosetta分別接種至含有Amp(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl)中，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后按1%的接種量接種到新鮮的含Amp(50 mg/L)、含葡萄糖(4%)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在0．6～0．7之間。然后加入終濃度為0．5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。收集菌體，并進(jìn)行Pla a1表達(dá)蛋白的SDSPAGE。電泳方法參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。取1．5 ml菌液離心收集菌體，加入100 μl 2×上樣緩沖液(20 g/L SDS、500 ml/L 甘油、62．5 mmol/L Tris-HCl(pH6．8)、20 ml/L β-巰基乙醇、0．1 g/L 溴酚藍(lán)、30 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA)充分混合，煮沸5分鐘后，12 000 r/min離心SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1．2．4 鑒定蛋白表達(dá)形式 安裝上述方法誘導(dǎo)蛋白表達(dá);4℃、10 000 r/min、6分鐘收集菌液，按菌體濕重為5ml/1g加結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8)充分重懸菌液。冰水浴中超聲裂解，裂解5秒停5秒，強(qiáng)度50%，100 W，裂解10分鐘;4℃，12 000 r/min，30分鐘離心分別收集上清1和沉淀;對(duì)上述沉淀再次用相同體積的結(jié)合緩沖液重懸洗劑，4℃，12 000 r/min，30分鐘離心再次收集沉淀;對(duì)沉淀加入相同體積含6 mmol/L尿素結(jié)合緩沖液(100mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA，pH8．0)，重懸沉淀，4℃搖床裂解過(guò)夜;4℃，18 000 r/min，30分鐘離心收集上清2;SDS-PAGE鑒定表達(dá)蛋白是否為包涵體形式。

1．2．5 Pla a1表達(dá)蛋白的純化 將變性后蛋白分別在含4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液各透析12小時(shí)。透析后的液體經(jīng)4℃，18 000 r/min，10分鐘收集上清3，準(zhǔn)備過(guò)柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。購(gòu)買于GE公司的Strep Trap HP 1 ml預(yù)裝柱與AKTA FPLC連接并首先用結(jié)合緩沖液按1 ml/min流速平衡柱子，至紫外基線平穩(wěn);將上清3上樣過(guò)柱，并用結(jié)合緩沖液洗柱。并收集穿透峰，用洗脫緩沖液洗柱(2．5 mmol/L脫硫生物素100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8．0)并收集洗脫峰。SDS-PAGE蛋白電泳鑒定洗脫峰及穿透峰。

1．2．6 純化蛋白Western blot鑒定分析 純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的PBST緩沖液 (8 g/L NaCl 0．28 g/L KCl 0．28 g/L KH2PO4，2．98 g/L Na2HPO4·12H2O，pH7．4;1 ml/L Tween 20)室溫封閉2小時(shí)后，加入法桐花粉過(guò)敏患者血清(一抗1∶1稀釋)，4℃三維搖床過(guò)夜孵育;用PBST在室溫下三圍搖床上洗4次，每次5分鐘;再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgE抗體(1∶500)，室溫孵育1小時(shí)，用PBST在室溫下三圍搖床上洗2次，每次5分鐘;再用PBS洗2次，5分鐘;用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色液顯色10分鐘，檢測(cè)Pla a1的抗原性。

1．2．7 純化后的表達(dá)蛋白送測(cè)序 SDS-PAGE蛋白電泳后，剪取合適大小的PVDF膜，在橫流45 mA室溫條件下進(jìn)行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間為28分鐘。轉(zhuǎn)印結(jié)束，考馬斯亮藍(lán)染色(0．1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶于40%甲醇/1%乙酸)染色30秒，用脫色液(1%醋酸+50%甲醇脫色)，脫色后用去離子水充分洗滌，然后剪下待測(cè)序的條帶，封存在1．5 ml的離心管中送中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心測(cè)序。

2 結(jié)果

2．1 重組表達(dá)載體的鑒定 重組載體構(gòu)建成功后以T7啟動(dòng)子開始，在NdeⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)之間為目的片段，PstⅠ酶切位點(diǎn)之后為8個(gè)氨基酸的Strep TagⅡ、雙終止密碼子TAATAA及XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PET44a-Pla a1重組子轉(zhuǎn)入JM109，對(duì)規(guī)整化后的菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果如圖1。1～9為目的片段，菌落PCR目的片段在500 bp左右，符合目標(biāo)片段大小。質(zhì)粒測(cè)序的結(jié)果與原始序列同源性為100%，可以進(jìn)行下一步原核表達(dá)菌株構(gòu)建。

2．2 Pla a1蛋白表達(dá)及鑒定 圖2所示，Pla a1在表達(dá)菌株Rosetta中的誘導(dǎo)表達(dá)，2～4在IPTG濃度為0．5 mmol/L誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照樣品。在對(duì)照和誘導(dǎo)間(18 kD處)出現(xiàn)明顯差別，表明外源基因進(jìn)行了Pla a1蛋白表達(dá)。采用的marker為03-04蛋白marker。

2．3 鑒定蛋白表達(dá)形式 在進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)后的收菌，加非變性裂解液，進(jìn)行超聲裂解，裂解后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。如圖3:1為對(duì)照，2為誘導(dǎo)，3為超聲裂解后上清，4為超聲裂解后沉淀。由此可見目的蛋白主要包涵體表達(dá)。

圖1 JM109菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig．1 PCR amplification of the Pla a1 gene

2．4 Pla a1融合蛋白的純化 利用AKTA FPLC將經(jīng)過(guò)StrepTrap HP 1 ml預(yù)裝柱所收集的液體分別取100 μl加入20 μl 6 × loading buffer(內(nèi)含 β-巰基乙醇)煮沸6分鐘后，離心(10 000 r/min，5分鐘)后取其上清10 μl跑SDS-PAGE膠，如圖4:1為穿透峰;2為目的蛋白洗脫峰。1泳帶為上樣后穿透峰所收集的液體，2泳帶為蛋白洗脫時(shí)紫外吸收峰大于50 mA時(shí)所收集的液體。

圖2 Pla a1基因誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定Fig．2 Protein expression of Pla a1 gene

圖3 重組蛋白表達(dá)形式鑒定Fig．3 Identification of inclusion body protein

圖4 重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳鑒定Fig．4 Identification of the purified recombinant protein by SDS-PAGE

2．5 純化蛋白Western blot鑒定分析 將誘導(dǎo)純化后蛋白利用法桐花粉過(guò)敏患者血清進(jìn)行免疫印跡鑒定如圖5，泳道1為正常血清對(duì)照;2～6所用患者血清均經(jīng)過(guò)ImmunoCAP檢測(cè)，并且血清中法桐花粉變應(yīng)原特異性IgE抗體均在二級(jí)以上。從圖5中可以看到在第2～6泳道內(nèi)目標(biāo)大小處有一條清楚的顯色條帶，表明此目的蛋白具有一定抗原性。

圖5 重組Pla a1蛋白的Western blot鑒定Fig．5 Identification of the Pla a1 protein by Western blot

圖6 重組蛋白測(cè)序結(jié)果Fig．6 Result of N-terminal amino acid sequence of protein Pla a1

2．6 純化后的融合蛋白送測(cè)序 純化后的融合蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜后送中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心測(cè)序。蛋白質(zhì)N-端1～6個(gè)氨基酸序列測(cè)序圖譜如圖6。

3 討論

大量的花粉流行病學(xué)調(diào)查資料顯示我國(guó)以及歐美國(guó)家法桐花粉飄逸廣泛［1，2，4，11］，更多的文獻(xiàn)指出法桐花粉已經(jīng)引起相關(guān)花粉癥大量出現(xiàn)，如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、蕁麻疹等［7，9，12-15］。但是對(duì)法桐花粉主要變應(yīng)原鮮有研究，本文對(duì)法桐花粉主要變應(yīng)原進(jìn)行了表達(dá)、純化及免疫印記鑒定。

大量研究表明，影響外源基因表達(dá)效率的重要因素為密碼子偏愛性、mRNA穩(wěn)定性、翻譯起始效率和載體選擇等［16］。密碼子的偏愛性研究在近年來(lái)成為熱點(diǎn)，如果目的基因的密碼子與表達(dá)宿主不匹配，則會(huì)降低mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性，甚至?xí)斐蒻RNA翻譯的提前終止［17］。本課題通過(guò)密碼子優(yōu)化使GC含量由44．3%變?yōu)?7．6%，在翻譯起始區(qū)盡量選用最優(yōu)密碼子，并且充分考慮RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使起始翻譯區(qū)處于線性開放結(jié)構(gòu)，這樣使蛋白質(zhì)翻譯更容易進(jìn)行。

本課題收集法桐花粉變應(yīng)原皮試過(guò)敏患者血清18例，利用ImmunoCAP檢測(cè)，9名患者血清法桐花粉變應(yīng)原特異性IgE抗體檢測(cè)均在二級(jí)以上，利用純化后的外源目的蛋白與這9名法桐花粉過(guò)敏血清進(jìn)行免疫印記實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示有5例發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)率超過(guò)50%，經(jīng)免疫印跡鑒定為法桐花粉主要變應(yīng)原蛋白，并且證明該外源重組蛋白具有相應(yīng)的抗原性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程制備重組花粉主要變應(yīng)原用于變態(tài)反應(yīng)性疾病的臨床診療和研究已成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)科的發(fā)展方向之一。重組變應(yīng)原具有純度高、產(chǎn)量高、易于標(biāo)準(zhǔn)化、無(wú)外源性毒性物質(zhì)和病原微生物污染的優(yōu)勢(shì)。體外試驗(yàn)及皮膚試驗(yàn)的結(jié)果均表明，大部分基因重組變應(yīng)原的變應(yīng)原活性與天然變應(yīng)原相當(dāng)［18］。構(gòu)建含有變應(yīng)原編碼基因的重組質(zhì)粒，表達(dá)出有功能活性的重組變應(yīng)原是臨床診斷和治療過(guò)敏性疾病的需要，也將為深入研究變應(yīng)原分子結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制提供材料。本課題工作為后續(xù)低致敏過(guò)敏原的改造及變應(yīng)原核酸疫苗的獲得奠定基礎(chǔ)。

致謝:本實(shí)驗(yàn)在廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，變態(tài)反應(yīng)研究室，過(guò)敏反應(yīng)與臨床免疫重點(diǎn)研究室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師、同學(xué)對(duì)我的幫助、支持。

1 Kosisky S E，Marks M S，Nelson M R．Pollen Aeroallergens in the Washington，DC，Metropolitan Area:A 10-Year Volumetric Survey(1998-2007)［J］．Ann Allergy Asthma Immunol，2010;104(3):223-235．

2 Aira M J，Rodriguez-Rajo F J，F(xiàn)ernandez-Gonzalez M et al．Airborne Pollen of Ornamental Tree Species in the NW of Spain［J］．Environ Monit Assess，2010;173(1-4):765-775．

3 Ture C，Bocuk H．Analysis of airborne pollen grains in bilecik，Turkey［J］．Environ Monit Assess，2009;151(1-4):27-35．

4 Celenk S，Canitez Y，Bicakci A et al．An Aerobiological study on pollen grains in the atmosphere of North-West turkey［J］．Environ Monit Assess，2009;158(1-4):365-380．

5 劉光輝，祝戎飛，張 威et al．湖北省氣傳花粉調(diào)查［J］．中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2007;1(001):22-26．

6 盧家美，孫秀珍，劉 昀et al．西安市氣傳花粉調(diào)查［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010;31(04):472-474，480．

7 Lauer I，Miguel-Moncin M S，Abel T et al．Identification of a Plane Pollen Lipid Transfer Protein(Pla a 3)and its immunological relation to the Peach Lipid-Transfer Protein，Pru P 3［J］．Clin Exp Allergy，2007;37(2):261-269．

8 Asturias J A，Ibarrola I，Eraso E et al．The major platanus acerifolia pollen allergen Pla a 1 has sequence homology to invertase inhibitors［J］．Clin Exp Allergy，2003;33(7):978-985．

9 Ibarrola I，Arilla M C，Martinez A et al．Identification of a Polygalacturonase as a Major Allergen(Pla a 2)from Platanus Acerifolia Pollen［J］．J Allergy Clin Immunol，2004;113(6):1185-1191．

10 Laemmli U K．Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］．Nature，1970;227(5259):680-685．

11 Celenk S，Bicakci A，Tamay Z et al．Airborne Pollen in European and Asian parts of istanbul［J］．Environ Monit Assess，2009;164(1-4):391-402．

12 Subiza J，Cabrera M，Valdivieso R et al．Seasonal asthma caused by Airborne Platanus Pollen［J］．Clin Exp Allergy，1994;24(12):1123-1129．

13 Pazouki N，Sankian M，Leung P T et al．Identification of cyclophilin as a novel allergen from platanus orientalis pollens by mass spectrometry［J］．J Biosci Bioeng，2009;107(2):215-217．

14 Fernández-González D，González-Parrado Z，Vega-Maray A M et al．Platanus Pollen Allergen，Pla a 1:Quantification in the atmosphere and influence on a sensitizing population［J］．Clinical＆ Experimental Allergy，2010;40(11):1701-1708．

15 Varela S，Subiza J，Subiza J L et al．Platanus pollen as an important cause of pollinosis［J］．J Allergy Clin Immunol，1997;100(6 Pt 1):748-754．

16 Baneyx F．Recombinant protein expression in Escherichia Coli［J］．Current Opinion in Biotechnology，1999;10(5):411-421．

17 鄭彬瓊．大腸桿菌同義密碼子偏好性概述［J］．硅谷，2009;(01):3，24．

18 Nikolaizik W H，Weichel M，Blaser K et al．Intracutaneous tests with recombinant allergens in cystic fibrosis patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis and aspergillus allergy［J］．Am J Respir Crit Care Med，2002;165(7):916-921．