亞甲基藍對大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機理*

唐姝姝，唐書澤，李紅愛，吳希陽，陳振強

1(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

2(暨南大學光電工程系，廣東廣州，510632)

亞甲基藍對大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機理*

唐姝姝1，唐書澤1，李紅愛1，吳希陽1，陳振強2

1(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

2(暨南大學光電工程系，廣東廣州，510632)

探討亞甲基藍對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機理。通過細菌平板菌落計數法研究亞甲基藍對腸出血性大腸桿菌O157的光動力殺傷作用，同時運用實時熒光定量PCR技術和聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察光動力技術對O157的基因組DNA的損傷程度和蛋白質降解效果。結果表明，當亞甲基藍的濃度為10 mg/L，可見光(光功密度為200 mW/cm2)光照30 min時，幾乎全部的腸出血性大腸桿菌O157能被殺死，并伴隨有DNA斷裂和蛋白質降解。亞甲基藍對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157有非常明顯的光滅活效應，其滅活機理可能是對基因組DNA的損傷以及蛋白質的降解。

亞甲基藍，腸出血性大腸桿菌O157，光動力滅菌技術，脫氧核糖核酸損傷，蛋白質降解

傳統的殺菌技術主要借助熱或化學的手段來滅菌，這通常會導致食品中不良的物理和化學變化?？股氐臑E用導致潛在的“超級細菌”爆發(fā)，迫使人們開始尋求新型、非熱能、生態(tài)友好和經濟有效的殺菌技術[1］。光動力滅菌技術(APDT)則是其中的一種。APDT基于光動力作用，利用光敏劑對活性細菌的優(yōu)先聚集特性，在特定波長的光源照射激發(fā)下，光敏劑吸收光子的能量，產生單態(tài)氧、自由基等活性氧物質，這些物質能通過氧化作用殺傷靶細胞，且不傷害周圍組織和細胞[2］。革蘭氏陰性菌由于具有復雜的細胞壁結構，屏蔽了細胞膜與單重態(tài)氧的有效結合，降低了光動力療法的殺傷作用[3-4］。

O157是腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic E.coli，EHEC)的主要血清型，屬于革蘭氏陰性菌，可通過污染的食物、水以及直接接觸感染的人或動物而感染。該菌是近幾年新發(fā)現的危害嚴重的新型人類致病菌，能夠引起人類出血性腹瀉(HC)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，甚至引發(fā)死亡[5］。自1982年在美國首次發(fā)現由腸出血性大腸桿菌O157引起的食物中毒爆發(fā)以來，國內外由該菌感染致病的病例數已呈明顯上升趨勢，引起了人們的廣泛關注。

亞甲基藍屬吩噻嗪衍生物，在水溶液中帶有陽性電荷，是第2代光敏劑，其最大吸收波長為600～700 nm，激活后生成的光敏復合物對病毒包膜和核酸有損傷作用[6］。國外從20世紀90年代起已開展了基于亞甲基藍的光滅活血漿中病毒的研究工作，但在微生物方面的應用才剛剛起步[7］。本課題選擇腸出血性大腸桿菌O157作為實驗菌株，通過平板菌落計數，熒光定量PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，探討亞甲基藍的光動力殺菌技術對革蘭氏陰性菌株的滅活效果及作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157，廣州市疾病預防控制中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌計數培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器

亞甲基藍(MB)(10 g/L)，上海紅綠光敏劑研究所有限公司;U21901雙光束紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;75 W溴鎢燈(光功密度200 mW/cm2)，北京卓立漢光儀器有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒，廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.4 引物合成

針對腸出血性大腸桿菌O157的特異基因rfbE設計引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。其序列如下，上游引物:5＇-CTACAGGTGAAGGTGGAATGG-3＇;下游引物:5＇-TTCCTCTCTTTCCTCTGCGG-3＇。

1.2 腸出血性大腸桿菌O157的光動力滅活試驗

1.2.1 細菌接種及培養(yǎng)

將活化的大腸桿菌的菌懸液以1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至對數生長期，離心收集菌體(4000 r/min，10 min)，棄去上清液，使菌體重新懸浮于0.1 mol/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并使其OD600=0.5(相當于107CFU/mL左右)。

1.2.2 光敏劑梯度稀釋[8］

用PBS稀釋MB，加入菌液，配置MB終濃度分別為0，1，5，10，25，50 mg/L的菌懸液，備用。

1.2.3 光敏劑濃度試驗

將不同濃度MB的菌懸液于37℃避光孵育30 min后進行光照，即在96孔板細胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照30 min。同時設置不光照組(L-)進行對照。

1.2.4 光照時間試驗

將MB濃度為10 mg/L的菌懸液于37℃避光孵育30 min后進行光照，即在96孔板細胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照0，5，10，20，30 min。同時設置不加光敏劑組(S-)進行對照。

1.2.5 細菌平板菌落計數

將1.2.3和1.2.4兩組處理所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋后，每個梯度各取100 μL于細菌平板菌落技術培養(yǎng)基平皿中，于37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后進行平板菌落計數并繪制失活率柱形圖。試驗重復3次，取平均值。

式中，N為對照組菌落數平均值;n為實驗組菌落數平均值。

1.3 腸出血性大腸桿菌O157的基因組DNA損傷試驗

1.3.1 細菌培養(yǎng)及前處理

按1.2.1的方法培養(yǎng)并收集腸出血性大腸桿菌O157菌液，用PBS稀釋MB后加入收集的菌液，配置MB的終濃度為10 mg/L的菌懸液。在96孔板細胞培養(yǎng)板任取5孔，分別加入200 μL菌懸液，37℃避光孵育30 min，放在距離溴鎢燈光源20 cm處光照30 min(S+L+)，同時設置加光敏劑不光照(S+L-)，不加光敏劑但光照(S-L+)和不加光敏劑且不光照(S-L-)作為對照。

1.3.2 細菌基因組DNA的提取

取1.3.1中4組處理方法所得的各1 mL菌懸液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進行腸出血性大腸桿菌O157的基因組DNA提取，提取出的DNA作為實時熒光定量PCR檢測腸出血性大腸桿菌O157的特異性基因rfbE的模板。

1.3.3 實時熒光定量PCR擴增

確定最佳反應體系以及反應條件，用制備的模板進行SYBR Green-I熒光定量PCR試驗。該反應的總體系為25 μL，其中，2×SYBR Green Premix Ex Taq母液12.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，滅菌去離子水9.5 μL。反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性5 s，57℃退火15 s，共擴增40個循環(huán)。

1.4 腸出血性大腸桿菌O157的蛋白質降解試驗

1.4.1 細菌培養(yǎng)及前處理

參照1.3.1的方法。

1.4.2 SDS-GAGE分析菌體全蛋白降解試驗

將1.4.1中4種處理方法所得的各1 mL菌懸液，置于1.5 mL EP管中，離心(10000 r/min，2 min)后棄上清液，向菌體中加入20 μL無菌去離子水使菌體懸浮。加入5 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液，于95℃下加熱5 min后進行SDS-PAGE試驗。

1.5 統計分析

用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，結果以平均值±標準差表示，顯著性差異用t檢驗，P＜0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 MB濃度對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

各濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157的光動力滅活作用見圖1和圖2。在MB濃度低至1 mg/L時，光照30 min能使約91%的腸出血性大腸桿菌O157滅活;當MB濃度達到50 mg/L的時候，幾乎可以使全部的腸出血性大腸桿菌O157滅活。表明在光照條件下，隨著MB濃度的增加，光動力對O157的殺傷作用逐漸增強。而光敏劑對照組和光照對照組均沒有非常明顯的殺傷效果。

2.2 光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

在MB濃度相同的情況下不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響見圖3和圖4。當MB濃度固定在10 mg/L時，光照5 min以上即可使絕大部分的腸出血性大腸桿菌O157失活;當光照時間達到30 min時，可以使腸出血性大腸桿菌O157的失活率達到99.9999%。這表明在MB的濃度一定時，隨著光照時間的延長，光動力殺菌技術對腸出血性大腸桿菌O157的殺傷作用逐漸增強。

圖1 不同濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(CFU)的影響

圖2 不同濃度MB對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

圖3 不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(CFU)的影響

2.3 MB-APDT對腸出血性大腸桿菌O157基因組DNA的損傷效果分析

圖4 不同光照時間對腸出血性大腸桿菌O157失活率的影響

針對腸出血性大腸桿菌O157的特異基因rfbE設計引物，進行實時熒光定量PCR試驗，結果見圖5和圖6。實驗組的DNA模板的量相對于對照組確實有很大程度的減少。之后進行了溶解曲線分析，樣品的擴增產物的溶解溫度是在81℃左右，在其他溫度下并沒有出現非特異性擴增(見圖6)，證明了產物的專一性。這表明在一定濃度的光敏劑和適當的光照時間下能夠引起腸出血性大腸桿菌O157的基因組斷裂，且損傷程度較大。

圖5 標準模板的實時熒光定量PCR擴增曲線

圖6 標準模板的熔融曲線

2.4 MB-APDT對腸出血性大腸桿菌全蛋白降解效果的影響

MB-APDT對腸出血性大腸桿菌O157的全蛋白降解效果見圖7。腸出血性大腸桿菌O157在加光敏劑MB(10 mg/L)且進行光照30 min的情況下，其菌體的大部分蛋白質被降解，只在30、32和65 ku這3處有不完全降解的較淺條帶出現。而光敏劑對照組、光照對照組及完全對照組則沒有變化。

圖7 MB-APDT處理后細菌全蛋白降解效果的SDS-PAGE圖譜

帶陰離子和電中性的光敏劑對革蘭氏陰性菌的殺傷作用小，而帶陽離子的光敏劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的殺傷作用[9］。本課題組前期的研究工作已經證實，光動力殺菌技術對曲霉孢子[10］、革蘭氏陰性菌金黃色葡萄球菌[11］及單核細胞增多性李斯特菌[12］具有良好的滅菌效果，本實驗進一步證實了MB在光照條件下對革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157也有很強的殺傷作用。但帶陽離子光敏劑對細菌有明顯殺傷作用的機理目前尚不清楚，Minnock等人認為可能是帶陽離子的光敏劑與細菌細胞的某種亞結構選擇性地結合，使得細菌對其更為敏感[13］。North等認為可能是帶陽離子的光敏劑與細胞膜所帶的負電荷容易產生靜電吸引力，使得光敏劑能夠穿透細菌的細胞壁與細胞膜有效結合，通過改變細胞膜的滲透性從而殺死細菌[14］。

3 結論

加入濃度為10 mg/L的MB，在光功密度為200 mW/cm2的溴鎢燈下光照30 min即能使腸出血性大腸桿菌O157的失活率達到99.9999%，并伴有基因組DNA損傷和蛋白質降解。亞甲基藍介導的光動力技術可能通過DNA損傷和蛋白質降解來實現對革蘭氏陰性菌的殺傷作用。因此，光動力殺菌技術也有可能被開發(fā)成一種有效的殺滅革蘭氏陰性菌的技術應用于肉類食品安全領域。

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ABSTRACTThe mechanisms of anti-microbial photodynamic technology(APDT)against Gram-negative bacteria Escherichia coli O157 by methylene blue(MB)was investigated.The bactericidal effect of MB-APDT on E.coli O157 was measured by counting the reduction of colony forming unit(CFU).The damage of DNA was observed by real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)and the degradation of proteins was investigated by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE).Results showed that almost all of the E.coli O157 were photo inactivated by illumination with 30 min visible light(power density 200 mW/cm2)in the presence of 10 mg/L MB.The significant photo-inactivation of Gram-negative bacteria Escherichia coli O157 may be due to the damage of DNAs and the degradation of proteins.

Key wordsmethylene blue，Escherichia coli O157，anti-microbial photodynamic technology，DNA damage，protein degradation

Mechanisms of Anti-microbial Photodynamic Technology Against Escherichia coli O157 by Methylene Blue

Tang Shu-shu，Tang Shu-ze，Li Hong-ai，Wu Xi-yang，Chen Zhen-qiang
1(Department of Food Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)
2(Department of Optoelectronic Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

碩士研究生(唐書澤教授為通訊作者)。

*暨南大學科研培育與創(chuàng)新基金項目

2012-03-14，改回日期:2012-05-22