茚三酮薰顯法在人體接觸細胞發(fā)現采集中的應用

楊 電，劉 超，徐曲毅，張 翼

（廣州市刑事科學技術研究所，廣東 廣州510030）

茚三酮薰顯法在人體接觸細胞發(fā)現采集中的應用

楊 電，劉 超，徐曲毅，張 翼

（廣州市刑事科學技術研究所，廣東 廣州510030）

目的 研究茚三酮薰顯法在人體接觸細胞發(fā)現采集中的應用價值。方法 對衣服、口罩、棍棒等可疑人體接觸細胞檢材258份，采用1%茚三酮溶液進行顯色反應，然后用磁珠法提取DNA，并進行DNA定量和STR檢測。結果 可疑人體接觸細胞檢材中有172份顯色反應陽性，其中115份檢出的DNA濃度在0.02ng/μL以上并檢出6個以上STR基因座的基因型，檢出率為66.86%；顯色反應陰性的86份檢材均未檢出DNA濃度或成功進行STR基因型。結論 茚三酮薰顯技術可用于指導案件人體接觸細胞的發(fā)現采集。

法醫(yī)遺傳學；人體接觸細胞；茚三酮顯現技術；STR分型

Abstract：ObjectiveTo evaluate the applicability of the ninhydrin-dyed method in the detection of human epithelial cells.Method 258 samples of clothes，masks and staves which might bear epithelial cells，were dyed with 1%ninhydrin，and DNA specimens were extracted by the magnetic beads method.Then DNA quantification and STR genotyping were performed to the collected samples.Results172 samples showed positive result，of which 115 had DNA concentrations above 0.02ng/μL and no less than 6 STR loci，with a detection rate of 66.86%.86 samples showed negative result，of which neither DNA nor STR loci could be detected.ConclusionNinhydrin-dyed method can be applied in the detection of human epithelial cells.

Key words：forensic genetics；epithelial cell；ninhydrin-dyed method；STR genotype

隨著DNA檢驗在案件偵破中發(fā)揮的作用越來越強，近年來人體接觸細胞檢材的數量直線上升。人體接觸細胞檢材與常見生物檢材如血痕、精斑相比，肉眼觀察很難判斷是否存在人體接觸細胞及其在載體上的具體部位、數量的多少。因此迫切需要一種可指示人體接觸細胞存在的簡便有效方法以幫助法醫(yī)工作者有效地對人體接觸細胞進行提取、富集，提高DNA檢驗的成功率。2004年，M.M.Schulz等[1]人曾報道在1宗兇殺案中利用茚三酮顯現潛在手印的方法作為發(fā)現人體接觸細胞的預試驗取得了良好效果。但目前國內只是對顯現的指印進行DNA檢驗進行了較多的研究[2-3]，對手印顯現方法用于尋找人體接觸細胞的預試驗方法的研究尚未見報道。本文采用1%茚三酮溶液薰顯案件提取的可疑人體接觸細胞檢材，提取DNA同時進行DNA定量和STR分型。結果表明，茚三酮薰顯技術在指示人體接觸細胞存在方面具有簡便快捷直觀、不影響DNA檢驗的優(yōu)越性，可用于指導案件人體接觸細胞的發(fā)現采集。報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

衣服、褲子、口罩、帽子、棍棒、紙張、枕套、手套、電線、螺絲批、飲料瓶口、杯口、各種擦拭物等可疑人體接觸細胞檢材258份，均為2010年以來廣州市刑事科學技術所實際案件檢材。

1.2 實驗方法

1.2.1 茚三酮熏顯

配制1%茚三酮乙醇溶液于噴罐中。對紙張、手套、口罩等淺色滲透性載體采用茚三酮溶液均勻噴霧后置溫度70℃的茚三酮熏顯柜中處理10min[4]。對頭套、深色手套等深色載體采用生物脫落細胞提取儀（公安部物證鑒定中心）吸取或脫落細胞粘取器（公安部物證鑒定中心）粘取，電線、螺絲批等非滲透性載體上可能存在人體接觸細胞的部位采用脫落細胞粘取器粘取或棉簽擦取；將吸附后的濾膜、粘附的膠帶紙或擦拭物置離心管中滴加茚三酮溶液濕潤后70℃保溫5min。對棍棒等無法置熏顯柜中熏顯的大件物品用茚三酮溶液噴霧后置室溫6h以上[5]。檢材熏顯時均同時設已知陽性和陰性對照。

1.2.2 DNA提取

對可疑接觸檢材中茚三酮顯色陽性者提取陽性部位，陰性者按經驗提取檢材，然后按文獻[5]在Maxwell（美國Promega公司）16自動儀上提取DNA，洗脫體積均為 30μL。

1.2.3 DNA定量

按Quantifiler法醫(yī)人類DNA定量試劑盒（購自美國AB公司）使用手冊在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行定量PCR反應。

1.2.4 STR復合擴增和檢測分型

用SinofilerTM Kit（美國AB公司）進行復合擴增，擴增體系為10μL，模板量為4μL。在3130xL遺傳分析儀（美國AB公司）上進行毛細管電泳檢測分型。

《法庭科學DNA數據庫建設規(guī)范》中規(guī)定，D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16 S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、VWA、FGA 等 13個核心基因座和Amelogenin基因座中須有任意6個以上的基因座檢測成功，方能將DNA分型數據及信息代碼輸入省級DNA數據庫和市級DNA數據庫。借鑒此標準，本研究將檢出6個以上數量的基因座（RFU≥50）認為檢出，反之則為未檢出。

2 結果

2.1 茚三酮熏顯反應

圖1為部分可疑人體接觸細胞檢材茚三酮熏顯后的照片。258份可疑人體接觸細胞檢材，有172份顯呈藍紫色陽性反應，其中一件確定放置6個月以上的穿過的衣服和一把放置3個月以上的用過的牙刷也顯示出陽性反應。另外86份可疑人體接觸細胞檢材未呈現顏色反應。

2.2 DNA定量及STR檢驗結果

172份茚三酮反應陽性的樣品中有115份檢出的DNA濃度在0.020ng/μL以上并檢出6個以上基因座的基因型，檢出率為66.86%；另57份樣品檢出DNA濃度在0.02ng/μL以下，且在空白對照正確的情形下，檢出的基因座數均小于2個，因此視為未檢出。茚三酮反應陰性的86份樣品無一例測出DNA濃度，STR分型結果也與空白對照一致（見表1）。

表1 258份檢材經茚三酮熏顯后提取DNA的STR檢驗結果

圖1 部分可疑人體接觸細胞檢材茚三酮熏顯后的照片

2.3 案例應用

2011年某月某日，廣州市公安局禁毒支隊破獲一宗制販毒案，在某農場內搗毀一個制毒工廠，繳獲制毒工具一批。為確定進出制毒工廠的嫌疑人，提取了工廠內發(fā)現的7根吸管、6個一次性塑料杯、5枚煙頭和6把牙刷要求進行DNA檢驗。對上述檢材采用茚三酮進行顯色反應，7根吸管、3個一次性塑料杯、2枚煙頭和2把牙刷呈現蘭紫色陽性反應，3個一次性塑料杯、3枚煙頭和4把牙刷顯色反應陰性。對所有檢材采用磁珠法提取DNA后進行DNA定量和STR反應，顯色反應陽性的5根吸管、2個塑料杯、2枚煙頭和2把牙刷檢出的DNA濃度≥0.10ng/μL，并成功檢出共6名男性個體的15個STR基因座基因型，顯色反應陽性的2根吸管、1個塑料杯未檢出DNA濃度和STR基因型。顯色反應陰性的3個塑料杯、3枚煙頭和4把牙刷均未檢出DNA濃度和STR基因型。

3 討論

人體接觸細胞的DNA檢驗是法醫(yī)DNA檢驗的熱點和難點之一。隨著DNA檢驗靈敏度的提高，特別是近年來MiniSTR、單細胞DNA檢驗和1μl體系擴增等新技術的出現，使DNA含量少于100pg的LCN樣品也能夠有效分型，甚至只含有單個細胞的微量生物檢材也有成功分型的報道。但是，目前對人體接觸細胞檢材的檢驗成功率并不高，許多檢材如刀柄、棍棒、繩索、指印上的人體接觸細胞檢驗成功率不到30%。這主要原因在于肉眼觀察難以判斷人體接觸細胞的有無及在載體上的具體部位、數量的多少。顯微鏡檢查是確證人體接觸細胞存在的金標準，但不能對載體上的人體接觸細胞直接檢查，將載體上的人體接觸細胞轉移下來涂片檢查操作繁瑣，操作過程中可能造成污染和細胞損失，因此實際檢案中很少采用顯微鏡對人體接觸細胞進行檢查。國外有研究采用熒光光譜和拉曼光譜分析技術對精液、汗液、唾液、尿液等體液斑進行無損性的預試驗檢測，但設備要求高，且只是處于研究階段[6]。而隨著證據意識的增強，辦案部門為了不放過任何一個可能留下嫌疑人信息的證據，對嫌疑人可能觸碰過的地方、物品凡是顯現不了指紋或指紋顯現不清的通通提取送檢DNA。1宗兇殺案往往提取幾十份甚至上百份檢材，其中大約一半為懷疑人體接觸細胞檢材。DNA檢驗工作者為了證實送檢的物品上是否存在人體接觸細胞，往往要反復多次地進行DNA提取、STR擴增和檢測的操作，浪費大量的人力、物力和時間。因此迫切需要一種可提示人體接觸細胞的存在及數量的多少的簡便有效方法以幫助法醫(yī)工作者提高接觸DNA檢驗的效率。

在手印顯現方法中，有些是利用化學試劑與指印中的氨基酸或蛋白質進行顯色反應或熒光反應[4]。現有研究均顯示這些手印顯現方法不影響DNA檢驗[1-3]。人體接觸細胞的形成原理與手印形成的原理一樣都是基于接觸-交換理論，由人體的皮膚粘膜與客體接觸后形成，人體接觸細胞中肯定含有氨基酸，因此采用針對氨基酸反應的潛在手印顯現方法作為指示人體接觸細胞存在的預試驗方法完全可行。

利用茚三酮與指印中的氨基酸或蛋白質進行藍紫色反應，是淺色滲透性載體上潛在指印顯現的經典方法。茚三酮薰顯方法操作簡單快速、顯色反應靈敏，不需要任何特殊設備，只需要普通的加熱裝置，甚至在室溫下也能完成薰顯，而且顏色鮮艷不褪色。本研究采用茚三酮薰顯方法對案件提取的258份可疑皮膚脫落細胞或口腔脫落細胞檢材進行薰顯反應，檢材上與人體接觸過的部位均呈藍紫色反應。在同一載體上，顏色反應的深淺程度與人體接觸程度正相關，與人體接觸的時間越長、接觸得越緊密，顏色反應越明顯。未與人體接觸的部位無顏色反應。172份陽性反應的樣品中有115份檢出6個以上基因座的基因型，檢出率為66.86%，而顯色反應陰性的86份檢材均未檢出STR基因型。可見，茚三酮薰顯方法可用于指導人體接觸細胞檢材的發(fā)現采集。

在利用茚三酮對人體接觸細胞檢材進行薰顯的過程中，本研究發(fā)現對于非滲透性載體、深色載體上可疑人體接觸細胞檢材，茚三酮難以直接薰顯，只能將其轉移到濾膜、膠帶紙或棉簽上再進行顯色反應，不能直接反映人體接觸細胞在這類載體上的原始分布情況。如何借鑒潛在指紋的其它顯現方法以指導非滲透性載體、深色載體上人體接觸細胞檢材的發(fā)現和采集，有待下一步研究。

[1]M.M.Schulz，H.-D.Wehner，W.Reichert，et al.Ninhydrindyed latent fingerprints as a DNA source in a murder case[J].Journal of Clinical Forensic Medicine，2004，（11）：202-204.

[2]王德明，顧麗華，閻建軍，等.3種提取膠帶粘面汗?jié)撝赣≈蠨NA 的方法比較[J].中國法醫(yī)學雜志，2005，20（2）：65-67.

[3]賴躍，王傳海，秦潔，等.8種方法顯現的汗?jié)撝赣TR分型研究[J].中國法醫(yī)學雜志，2007，22（6）：366-368.

[4]趙向欣.指紋技術[M].北京：中國公安大學出版社，2002：277-304.

[5]楊電，劉超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法結合Maxwell 16自動儀提取接觸 DNA進行 STR 檢驗[J].刑事技術，2011，（3）：3-5.

[6]Virkler Lednev I K.Analysis of body fluids for forensic purposes：from laboratory testing to non-destructive rapid confirmatory identification at a crime scene[J].Forensic Sci Int，2009，188（1/3）：1-17.

（本文編輯：李成濤）

Application of the Ninhydrin-dyed Method in the Detection of Human Epithelial Cells

YANG Dian，LIU Chao，XU Qu-yi，ZHANG Yi
（Guangzhou Criminal Science&Technology Institute，Guangzhou 510030，China）

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2012.05.016

1671-2072-（2012）05-0105-03

2012-02-17

公安部應用創(chuàng)新計劃資助項目（2005YYCX57136）；廣東省法醫(yī)遺傳學重點實驗室建設項目（2010A060801001）

楊電（1969—），女，主任法醫(yī)師，碩士，主要從事法醫(yī)DNA檢驗與研究工作。E-mail：yangdianyy@163.com。