中西醫結合心腦血管病雜志社大鼠腦梗死后神經前體細胞移行及電針作用的研究

王少帥，李常新，尤洪嶺，王艷艷

神經前體細胞（neural precursor cells，NPCs）具有自我更新和增殖為神經元和膠質細胞的能力。腦梗死后NPCs可移行至缺血灶周圍，補充、修復神經元的缺失和功能損傷，發揮內源性抗損傷修復作用[1]。本研究旨在動態觀察急性腦梗死及電針治療后梗死灶邊緣Brdu陽性細胞數和DCX陽性細胞數，探討腦梗死后電針治療對NPCs移行在中樞神經損傷修復中的作用。為卒中后神經功能恢復提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 動物來源及模型制備 選用2月～3月齡雄性SD大鼠（山西醫科大學實驗動物中心提供）60只，體重80g～120g，應用雙腎雙夾法復制易卒中型腎性高血壓大鼠（RHRSP）模型。用大鼠心率血壓計經尾部測血壓，腎動脈狹窄前測量1次，狹窄后每周1次。造模后16周取血壓≥180mmHg且無腦卒中癥狀，體重450g～500g的RHRSP大鼠，參照 Wahl等[2]的方法電凝MCA跨嗅束后的主干，并于顯微鏡下見MCA供血中斷，制成凝閉大腦中動脈（MCAO）模型。

1.2 神經功能評分 依照Garcia等[3]的18分綜合評分法。MCAO后12h始每日（1周后改為2次／周）由2人同時評分，其中1人不知觀察鼠屬于何組。

1.3 動物分組 采取隨機分組。對照組：RHRSP非MCAO（只作相同的開顱術，但不凝閉大腦中動脈）1周、2周、3周、4周，每周組3只，共12只；腦梗死組：RHRSP與 MCAO模型成功1周、2周、3周、4周，每周組6只，共24只；電針組：RHRSP與MCAO模型成功行電針治療1周、2周、3周、4周，每周組6只，共24只。

1.4 方法

1.4.1 Brdu標記 使用細胞增殖特異性標記物Brdu，以10 mg／mL溶于生理鹽水。各組于MCAO后24h始腹腔注射Brdu（50mg／kg）標記處于增殖狀態的NPCs。在注射日共注射3次，間隔8h。分組及在MCAO后注射時間為：1周組第6天；2周組第6、13天；3周組第6、13、20天；4周組第6、13、20、27天，各組最后一次注射后12h處死取腦。

1.4.2 電針治療 選穴穴位參考《實驗針灸學》[4]中常用實驗動物的針灸穴位而確定，針刺方法參考孟競壁等[5]操作方法，MCAO后24h，用30號1寸毫針刺入病灶對側，相當于人的手三里、外關、伏兔及足三里，進針深度2mm～3mm。針柄接至CMNS6－1型電子針灸治療儀行電刺激，1次／日。頻率2Hz連續波，輸出強度3，20min／次。6d一療程，停一天進行下一療程。腦梗死組只做相同捆綁而不針刺。

1.4.3 病理學檢查 經常規灌注后取腦，固定，脫水，石蠟包埋，由前向后作冠狀切片，片厚5μm，取經梗死灶周腦組織。行常規HE染色，觀察梗死灶周組織病變情況。梗死灶的計算：HE染色切片用Leica Q570圖像分析檢測。計算每張冠狀切片上梗死灶的面積，每個組織塊梗死灶體積按下列公式計算：V＝t1（A 1＋A 2）／2＋t 2（A 2＋A 3）／2＋…＋t n－1（An－1＋A n）／2（注：V為體積，t為兩相鄰冠狀面的間距，A為每一冠狀面上梗死灶面積，n為冠狀面序列號）。

1.4.4 免疫熒光染色 分別檢測各組不同時間點梗死灶周相同部位Brdu陽性細胞及DCX陽性細胞數。操作嚴格按照試劑盒說明進行，烤片，脫蠟，抗原修復，血清封閉，滴加熒光標記二抗，每張切片在灶周相同部位隨機觀察3個視野，400倍熒光顯微鏡下計數Brdu陽性細胞及DCX陽性細胞數。

2 結 果

2.1 模型制作結果 RHRSP術前血壓為110.08mmHg±11.91 mmHg，術后16周平均血壓為198.37mmHg±21.45mmHg。

2.2 神經功能評分 對照組評分18分（正常）。MCAO后評分隨時間逐漸增高，5d時恢復正常，電針后2d與3d大鼠行為學評分較梗死組高（與腦梗死組比較，經t檢驗，P＜0.05）。

2.3 不同時間點各組腦組織病理變化情況 HE染色可見對照組神經元分布均勻，間隙正常，細胞核圓形藍染。MCAO后1周梗死灶內腦組織軟化，細胞腫脹、胞漿液化，細胞及小血管周圍的間隙加寬。2周時上述區域為軟化灶，灶內有炎性細胞浸潤。3周、4周后病灶萎縮、深陷，灶內、灶周有疤痕形成，梗死后4周內隨著時間延長梗死體積漸縮小。電針治療后前3周梗死體積較腦梗死組縮小（P＜0.05），4周時無顯著差別。腦梗死灶大小比較見表1。

表1 大鼠腦內各時間點不同處理組腦梗死灶大小比較（±s） %

表1 大鼠腦內各時間點不同處理組腦梗死灶大小比較（±s） %

組別 1周 2周 3周 4周腦梗死組 19.26±5.81 16.32±4.39 14.33±3.51 10.62±4.21電針組 16.35±5.441） 13.61±3.201） 12.54±4.121） 9.81±3.11與梗死組比較，經t檢驗，1）P＜0.05

2.4 不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞數目 對照組Brdu陽性細胞數目很少，排列稀疏。腦梗死及電針治療后梗死灶邊緣Brdu陽性細胞數目較對照組均增多（P＜0.05），且電針組多于腦梗死組（P＜0.05），隨時間逐漸減少。腦梗死后腦內DCX陽性細胞數目增加，缺血1周時細胞數增加達高峰，之后逐漸減低；電針治療1周末細胞數目明顯增加，2周～4周隨時間延長數目較腦梗死組明顯減少。DCX陽性細胞突起長，有時連在一起似鏈狀；有的細胞突起對稱向各不同方向伸展。各組Brdu陽性和DCX陽性細胞數目詳情見表2。

表2 大鼠腦內不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞計數（±s） 個／400倍視野

表2 大鼠腦內不同處理組Brdu陽性和DCX陽性細胞計數（±s） 個／400倍視野

組別 1周Brdu＋ DCX＋2周Brdu＋ DCX＋3周Brdu＋ DCX＋4周Brdu＋ DCX＋對照組 1.20±0.65 10.04±3.25 3.05±1.47 7.44±1.95 1.65±1.02 9.19±3.03 2.29±1.25 7.68±2.08腦梗死組 57.50±11.041） 54.01±12.661） 83.80±10.811） 45.91±9.781） 53.45±9.29 34.92±7.551） 31.08±8.201） 24.38±5.501）電針組 78.61±13.881）2）62.22±16.731）2）97.15±15.911）2） 40.18±10.371）2） 69.69±12.011）2）29.50±6.491）2）32.36±9.191）16.91±4.671）2）與對照組比較，經t檢驗，1）P＜0.05；與梗死組比較，經t檢驗，2）P＜0.05

3 討 論

在正常成年哺乳動物腦內，NPCs主要存在于腦室區和腦室下區（SVZ）、連接側腦室和嗅球的區域以及海馬齒狀回。生理狀態下，NPCs有固定的遷移途徑，經吻側遷移流（RMS）遷移到嗅球分化成顆粒及球旁神經元。腦梗死后NPCs自SVZ呈鏈狀穿過胼胝體、紋狀體邊緣到達缺血區，發揮它們修復損傷的作用[6]。

Brdu為細胞增殖的標記物，在中樞神經系統可作為增殖的NPCs的標記物。Doublecortin（DCX）是神經細胞的重要微管相關蛋白，在移行的神經元祖細胞有很強的表達，可作為移行細胞標志物。Zhang等[7]在MCAO后7d處死大鼠，發現缺血灶周出現大量DCX陽性細胞。在腦缺血后，腦損傷后的微環境使NPCs發生遷移。應用時間延遲拍攝顯微鏡發現DCX陽性細胞由SVZ多個方向移行至缺血灶周圍，DCX可能作為一種內在蛋白來調節NPCs移行至缺血灶周圍。本研究也證實，MCAO后灶周DCX陽性細胞數目明顯增加，在1周末最多，之后逐漸減低。說明缺血可作為內源性因素誘導新生NPCs增殖并向梗死灶周圍移行，而缺血急性期為移行高峰期。Li等[8]觀察大鼠腦梗死后14d和30d行外周胡須刺激，發現DCX陽性細胞由SVZ移行至缺血灶周，外周刺激組細胞數明顯多于梗死組；外周刺激組梗死灶周圍Brdu＋／NeuN＋細胞數明顯多于梗死組，提示外周刺激能夠促進神經細胞移行，同時也發現外周刺激顯著增加血管內皮生長因子（VEGF）和基質衍生因子－1（SDF－1）在缺血灶周的表達。最近大量研究表明[9，10]，VEGF 和SDF－1在NPCs移行過程中發揮重要作用。

電針有改善神經功能缺損、保護腦缺血后神經元等作用。本實驗結果顯示，電針治療后3周內，梗死灶體積較腦梗死組明顯減小，行為學評分明顯低于腦梗死組，說明電針可減小腦梗死體積，促進神經功能恢復。MACO后各時間段電針組灶周Brdu陽性細胞數明顯多于腦梗死組；DCX陽性細胞數1周末明顯增加，2周～4周隨時間延長數目較腦梗死組明顯減少。證實電針能促進腦梗死后內源性NPCs增殖和向梗死灶周移行，且在梗死后一周效果最明顯。提示電針可能在急性期通過改變腦內微環境，影響VEGF、SDF－1等細胞因子來促使NPCs向灶周移行，形成對病灶進行修復的物質基礎。而隨著電針治療時間的延長，病灶逐漸恢復，推測可能影響移行的因子逐漸減少致使電針作用減弱。但電針與影響NPCs移行各因素的關系及具體作用機制，還有待于進一步的深入研究。

[1]Zhang RL，Zhang ZG，ZhangL，etal.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2001，105（1）：33.

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[3]Garcia JH，Wagner S，Liu KF，etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery oc－clusion in rats[J].Stroke，1995，26：627－635.

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[7]Zhang RL，Chopp M，Gregg SR，et al.Patterns and dynamics of subventricular zone neuroblast migration in the ischemic striatum of the adult mouse[J].Cereb Blood Flow Metab，2009，29（7）：1240－1250.

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