“種植窗”時期人類子宮內膜組織差異蛋白質表達譜的初步研究*

譚 真，李 潔，黎明濤，劉 煒，于文娟#，夏婷婷

(中山大學1附屬第一醫院生殖醫學中心，2中山醫學院研究中心蛋白質組學，廣東廣州510080)

“種植窗”時期子宮內膜形態與功能的及時轉換是胚胎著床與母胎界面形成的關鍵。長期以來，臨床工作中主要通過超聲測定內膜厚度與形態以及血清激素水平評價子宮內膜的功能狀態。然而血清雌、孕激素水平與子宮內膜發育并不完全同步，內膜的厚度與形態也不能準確說明其形態學改變。既往研究報道的子宮內膜上皮細胞吞飲泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管內皮生長因子的表達可以部分地反映子宮內膜對胚胎的接受性[1－2]。但至今為止，還未能找到更完整的、能動態反映子宮內膜對胚胎接受性變化的方法。

近年來基因芯片技術在人類子宮內膜研究的結果表明:“種植窗”時期存在多個基因表達的上調和下調[3－5]。然而關于功能基因蛋白質組群的表達和研究還未見報道。我們選擇正常生育能力婦女，采用熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D －DIGE)和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix－assisted laser desorption/ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)為主的蛋白質組學技術、Western blotting技術鑒定和分析子宮內膜組織蛋白質表達的變化，并查找文獻進行差異表達蛋白質功能的聚類分析，從整體水平、連續、動態地探討子宮內膜對胚胎接受性轉化過程中的分子生物學基礎。

材料和方法

1 材料來源

2005年9月～2006年2月募集有正常生育能力的女性志愿者4名并簽署知情同意書，年齡分別為30、30、32、33歲。采用經陰道超聲檢測卵泡發育結合血、尿黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激素測定。以血清LH＞20 IU/L或基礎值4倍確定為LH峰值日。分別于同一婦女同一月經周期“種植窗”前期(LH+2 d)和“種植窗”時期(LH+7 d)，采用Wallace endometrial sampler先后進行2次微創組織活檢，獲取子宮腔前、后壁內膜組織約0.2～0.4 g作為自身對照實驗材料。一部分組織行HE染色進行組織形態學和雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)測定評估，根據Noveys標準確定組織學分期。另一部分組織經裂解、勻漿、離心、純化、濃度測定后用于蛋白質組學差異表達和Western blotting半定量分析。

2 方法

2.1 2D－DIGE 熒光染料CyDyes標記樣品蛋白(熒光標記試劑盒，Amersham Biosciences)，進行一向等電聚焦電泳和二向十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳。激光掃描儀掃描成像，DeCyder軟件進行圖像分析，定量蛋白豐度差異，確定差異表達蛋白質斑點。根據以下3個標準:(1)比較LH+2 d和LH+7 d蛋白斑點的差異，進行t－test，P＜0.05;(2)灰度差異＞1.40倍;(3)同一蛋白在12個蛋白表達譜中出現≥10次，選取斑點作為入選的差異斑點。進一步刪除三維圖中無凸起、脫尾、與局部未入選斑點比較變化趨勢相同的斑點后確認將進入質譜分析的差異表達斑點，并在2張制備膠選中和標記相應斑點，建立切點目錄。

2.2 質譜分析 將切點目錄輸入全自動斑點處理工作站，進行斑點切割、沖洗、干燥、酶解消化、加入基質和質譜靶點樣等操作后，使用MALDI－TOFMS測定其在膠內酶降解后的肽質量指紋圖譜，并到本地和在線蛋白質數據庫驗證。

2.3 差異蛋白資料分析 登陸ExPASy網站尋找相關蛋白質的資料，在PubMed查閱相關文獻進行蛋白質功能聚類分析并探討其與胚胎著床關系。

2.4 Western blotting驗證蛋白質組學結果 選擇annexin IV作為目的蛋白，參照Western blotting(Cell Signaling)說明書操作。Western blotting顯影結果掃描定量分析目的條帶積分吸光度值(A值)。

3 統計學處理

結 果

1 子宮內膜組織時相和功能的確定

結果顯示，LH+2 d和LH+7 d子宮內膜分別呈現分泌早期和中期組織學改變，ER和PR表達符合正常黃體期子宮內膜組織的變化趨勢，提示子宮內膜時相正常，見表1。

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內膜形態和ER、PR檢測Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內膜形態和ER、PR檢測Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

Phase Histological change ER PR Epithelia Stroma cells Epithelia Stroma cells LH+2 d Early secretory phase 92.5 ±2.9 52.5 ±26.3 88.8 ±6.3 70.0 ±21.6 LH+7 d Mid －secretory phase 50.0 ±21.6 37.5 ±18.9 37.5 ±32.0 62.5 ±15.0

2 2D－DIGE圖譜

每張2D－DIGE凝膠經3種不同波長的激光掃描可得到3個分別由Cy2、Cy3和Cy5標記的不同蛋白質樣品圖像及合并的膠內差異圖像，見圖1，Decyder軟件分析檢測到(2 555±98)個蛋白質斑點。

Figure 1.2D －DIGE images of endometrial proteins during the implantation window.Individual proteins of endometrial LH+2 d，LH+7 d samples and a pooled internal standard were labeled with CyDyes Cy3，Cy5 and Cy2，and were mixed and separated on a 2D gel using 24 cm pH 3～10 NL strips in the first dimension and 10%SDS－PAGE gels in the second dimension.Gels were scanned to obtain single images of the internal standard(Cy2，red)(A)，LH+2 d proteins(Cy3，green)(B)and LH+7 d proteins(Cy5，blue)(C).An overlay of the three dyes(Cy2，Cy3，Cy5)(D)is shown.圖1 “種植窗”時期子宮內膜蛋白質的2D－DIGE凝膠圖像

3 MALDI－TOF－MS鑒定

根據實驗方法中判斷差異表達斑點的3個篩選標準獲得入選斑點167個，確認差異表達斑點81個進入MALDI－TOF－MS PMF法鑒定，并通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)和Swissprot在線檢索鑒定，查找和確認差異表達蛋白質共31個，其中17個上調表達，14個下調表達。

圖2～5顯示在2D－DIGE圖譜編號為2 033、pI約5.8、分子量約36的差異蛋白斑點的2D－DIGE斑點圖、三維圖、MS鑒定圖和Swissport在線檢索結果。該斑點經鑒定為annexin IV，LH+7 d蛋白質表達量為LH+2 d的2.12倍。

Figure 2.Three－dimensional view and spot map of annexin IV.圖2 AnnexinⅣ在LH+2 d和LH+7 d的差異表達圖

Figure 3.Graph view of annexin IV.圖3 AnnexinⅣ在LH+2 d/+7 d的差異表達圖

Figure 4.Mass spectral identification of annexin IV.圖4 AnnexinⅣ的質譜鑒定

Figure 5.The searching result of peptide mapping fingerprint by Swissprot database was annexinⅣ.圖5 肽指紋圖譜經Swissprot數據庫搜索結果為AnnexinⅣ

4 差異蛋白資料分析

登陸ExPASy網站尋找相關蛋白質的資料，在PubMed查閱相關文獻發現上述31個差異表達的蛋白質功能涉及到細胞遷移與融合、酶活性改變、信號轉導和基因調控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，見表2。

5 Western blotting測定annexin IV差異表達

圖6結果表明annexin IV在LH+2 d和LH+7 d A值分別為46.249±32.376和249.507±31.959，P＜0.01，提示LH+7 d子宮內膜組織annexin IV表達量較LH+2 d顯著增加。Western blotting結果與蛋白質組學分析annexin IV表達趨勢一致，證實蛋白質組學方法的準確性。

表2 31個“種植窗”時期人類子宮內膜組織差異表達的蛋白質Table 2.31 differentially expressed proteins identified in endowing the endometrium with receptivity

討 論

人類胚胎種植的低效率至今依然是生殖生物學領域中最大的挑戰。文獻報道這種低種植率現象與子宮內膜－胚胎發育不同步，臨床缺乏預測與評估胚胎發育潛能和子宮內膜對胚胎接受性的客觀方法密切相關。由于人類子宮內膜對胚胎接受性存在時、空的短暫性，即胚胎著床活動受到“種植窗”時期的限制，“種植窗”的啟動常常發生在內源性LH峰第4 ～5d，關閉發生在第9 ～10d[5]。因此探討在“種植窗”時期子宮內膜組織的分子生物學變化及其機制是一個亟待解決的重要課題。

Figure 6.Annexin IV and β －actin levels were determined by Western blotting in LH+2 d(group A，A1－A4)and LH+7 d(group B，B1－B4)tissues.圖6 Western blotting檢測LH+2 d和LH+7 d annexin IV表達和目的條帶積分吸光度值

子宮內膜是一種形態、功能都高度依賴激素調節的組織，增殖期子宮內膜向接受態的轉化嚴格受到雌、孕激素和目前還未知因素的調控。排卵后子宮內膜及時向接受態轉化，出現組織重建、細胞按一定的時、空順序分泌相關蛋白或/和局部因子，以期識別胚胎形成具有接受胚胎著床能力的子宮內膜。既往的研究由于被研究因子的獨立與局限、研究方法缺乏時、空連續性以及多因子表達的同期比較，其結果不足以真實地反映代表圍“種植窗”時期子宮內膜形態與功能轉化過程中局部因子的網絡聯系和調節機制。近年來基因芯片技術在該領域的應用結果已經證實“種植窗”時期出現了數十個與胚胎著床相關基因的上調或下調表達，并對小部分特異基因進行了篩選、分析和克隆研究[3－5]。但是基因表達的結果并不能完全預測蛋白質的表達、修飾與功能變化。而子宮內膜對胚胎接受性的功能改變是一個多基因、多步驟和多階段的過程，由不同功能的蛋白質在時間與空間上有序協同作用的結果。因此我們選用了能夠描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行相對定量測定的、反映蛋白質組分整體變化的蛋白質組學方法進行研究。

對復雜組織表達的多種蛋白質進行研究面臨的主要問題是生物學變異，包括個體差異和組織時相的差異。我們選擇正常生育能力的婦女，于同一月經周期LH+2 d和LH+7 d子宮內膜取材，挑選組織時相符合分泌早期和分泌中期配對的子宮內膜，從而減少了由于個體和組織時相差異導致的假陽性結果。“種植窗”時期子宮內膜處于高度血管化狀態，單純使用PBS沖洗不能有效去除血清蛋白，可能導致膠內特定區域分辨率下降，掩蓋非血清蛋白。本研究選擇Berendt等[6]報道的飽和蔗糖緩沖液(含104IU/L肝素)方法沖洗子宮內膜組織10 min，大幅降低血清蛋白，實驗結果顯示蛋白質圖譜未見明顯的血清蛋白點，進一步證實該方法的可行性。

本研究采用2D－DIGE是雙向電泳的重要創新，該方法使用熒光標記物預先標記蛋白樣品，采用多重分析方式，利用所有樣本中的蛋白質斑點同內標比較分析其差異值，能夠消除凝膠之間的偏差，減少實驗誤差，保證所檢測到蛋白豐度變化的精確度，且熒光檢測靈敏度高，檢測范圍廣，與傳統的雙向電泳相比有重復性好，準確性高、標準化和高效的優點[7]。從2D－DIGE圖譜中可見(2 555±98)個蛋白質斑點，該結果靈敏度與Marouga等[8]報道結果類似。參考本校蛋白質組學系統標準，采用2DDIGE方法可檢測到差異大于10%的蛋白質，為提高分辨率我們以差異＞1.4倍作為標準，選擇在12個蛋白表達譜中表達≥10次(P＜0.05)的斑點167個，確認差異表達斑點81個進行質譜鑒定。并通過NCBI和Swissprot在線檢索，查找和確認差異表達蛋白質共31個。Berendt等[6]報道pH 4～7和pH 7～9 IPG膠條進行同一小牛子宮內膜樣本IEF，分別獲得1180和350個蛋白斑點，提示本研究使用寬范圍的IPG膠條(pH 3～10)進行IEF。觀察2D－DIGE圖譜可見堿性端蛋白斑點密集，提示擴大等電點范圍電泳將有利于獲得更多的蛋白質斑點，針對該問題，今后研究可采用分離堿性蛋白質的IPG膠條(pH 6～11，8～11，9～12)以擴大獲得的差異蛋白質數量。

本研究獲得“種植窗”時期正常生育能力婦女子宮內膜組織差異表達蛋白質31個，包括膜蛋白、蛋白酶和肽、鈣離子結合蛋白、轉錄因子、細胞信號轉導因子、細胞黏附分子等，其中17個表達上調，14個表達下調。首次報道21個“種植窗”時期子宮內膜組織差異表達蛋白質，其中10個表達上調，11個表達下調。其中21個差異表達蛋白質與人類子宮內膜對胚胎接受性的關系還未見文獻報道。通過文獻查找發現31個差異表達的蛋白質功能涉及到細胞遷移與融合、酶活性改變、信號轉導和基因調控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，這些蛋白質功能與胚胎種植過程中所涉及的多種生物學活動相一致。值得注意的是與以往基因水平研究發現的基因表達存在較大差異[4－5]。這種現象是否與本研究使用的IPG膠條(pH 3～10)測定到的蛋白質有限或與從基因到蛋白質水平表達存在時空差異有關還需進一步實驗證實。

Annexin IV屬于annexin家族，是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，具有促進膜融合，參與囊胞運輸、鈣離子通道形成、細胞骨架活動、磷脂化與膜受體的功能調節以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物功能[9]。近年對annexin IV在腫瘤細胞擴散過程中的研究提示其可能參與生長、分化和細胞形態轉換過程[10]。而胚胎種植過程中子宮內膜從非接受態向接受態轉化過程中涉及上述類似的生物學過程。Riesewijk等[4]采用基因芯片技術比較LH+2 d/+7 d人類子宮內膜annexin IV基因表達發現在“種植窗”期上調4倍。本研究蛋白質組學結果顯示annexin IV表達增強2.12倍;Western blotting結果顯annexin IV表達趨勢與蛋白質組學結果一致，提示子宮內膜向接受態轉化過程中存在annexin IV表達量的顯著增加。此結果與Ponnampalam等[11]報道結果一致。同時驗證了我們建立的微創子宮內膜組織活檢取材方法聯合蛋白質組學研究體系的準確性和可靠性。

[1]Lindhard A，Bentin － Ley U，Ravn V，et al.Biochemical evaluation of endometrial function at the time of implantation[J].Fertil Steril，2002，78(2):221 －233.

[2]Tranguch S，Daikoku T，Guo Y，et al.Molecular complexity in establishing uterine receptivity and implantation[J].Cell Mol Life Sci，2005，62(17):1964 －1973.

[3]Kao LC，Tulac S，Lobo S，et al.Global gene profiling in human endometrium during the window of implantation[J].Endocrinology，2002，143(6):2119 －2138.

[4]Riesewijk A，Martin J，van Os R，et al.Gene expression profiling of human endometrial receptivity on days LH+2 versus LH+7 by microarray technology[J].Mol Hum Reprod，2003，9(5):253 －264.

[5]Mirkin S，Arslan M，Churikov D，et al.In search of candidate genes critically expressed in the human endometrium during the window of implantation[J].Hum Reprod，2005，20(8):2104－2117.

[6]Berendt FJ，Frohlich T，Schmidt SE，et al.Holistic differential analysis of embryo－induced alterations in the proteome of bovine endometrium in the preattachment period[J].Proteomics，2005，5(10):2551 －2560.

[7]Domínguez F，Garrido － Gómez T，López JA，et al.Proteomic analysis of the human receptive versus non－receptive endometrium using differential in－gel electrophoresis and MALDI－MS unveils stathmin 1 and annexin A2 as differentially regulated[J].Hum Reprod，2009，24(10):2607－2617.

[8]Marouga R，David S，Hawkins E.The development of the DIGE system:2D fluorescence difference gel analysis technology[J].Anal Bioanal Chem，2005，382(3):669 －678.

[9]李 潔，譚 真，黎明濤，等.膜聯蛋白IV蛋白差異表達與人類子宮內膜胚胎接受性關系的初步研究[J].中華婦產科雜志，2006，12(41):803 －805.

[10]Zimmermann U，Balabanov S，Giebel J，et al.Increased expression and altered location of annexin IV in renal clear cell carcinoma:a possible role in tumour dissemination[J].Cancer Lett，2004，209(1):111 －118.

[11]Ponnampalam AP，Rogers PA.Cyclic changes and hormonal regulation of annexin IV mRNA and protein in human endometrium[J].Mol Hum Reprod，2006，12(11):661 －669.