抗黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌篩選及其抑菌活性的初步研究

李麗梅，高丙利，柳 東，李興林

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

抗黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌篩選及其抑菌活性的初步研究

李麗梅1,2，高丙利2，柳 東1,2，李興林1

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

結合涂布平板法和溫室盆栽植株法，測定了41株枯草芽孢桿菌發酵液對灰霉病病原菌及黃瓜灰霉病的抑制效果，以此篩選出針對灰霉病的生防菌株．結果表明，抑菌效果最好的枯草芽孢桿菌為BS01和BS03．采用涂布平板法研究了菌株BS01和BS03抑菌活性，結果表明，抑菌效果均為50%時，BS03比BS01的菌體濃度低，得到抑菌效果最好的菌株BS03．采用溫室盆栽植株法測試了菌株BS03的抑菌活性，結果表明，菌懸液比發酵濾液的抑菌效果好，并且在菌懸液處理黃瓜苗后的第3天抑菌活性最高．

灰霉病；生物防治；枯草芽孢桿菌

植物真菌病害每年給糧食和蔬菜的生產造成巨大的損失．目前，普遍采用化學農藥防治植物病害．化學農藥毒害非靶標生物、污染環境并使有害生物產生抗藥性．而生物農藥具有選擇性高、易于降解、不易積累、用量少、污染小、對人畜毒性小、環境兼容性好、病蟲害不易產生抗性等優點[1]．因此，使用生物農藥是克服化學防治造成環境污染、破壞生態平衡的有效途徑之一[2]．

枯草芽孢桿菌是目前生物農藥中研究相對較多的一種細菌類微生物．該類菌在自然界中廣泛存在，是植物體內常見的內生細菌，對人畜無明顯毒害，具有顯著的抗菌活性和極強的抗逆能力，有利于生防菌劑的生產、加工和儲存，是一種理想的生防細菌．近年來，國內外學者在枯草芽孢桿菌防治植物病害方面進行了大量研究，并已開發出多種商品化菌劑應用于農業生產[3]．

然而枯草芽孢桿菌的主要防治對象是水稻紋枯病、小麥紋枯病、番茄葉霉病、豆類根腐病、蘋果霉心病、棉花立枯病、棉花枯萎病等．用于防治灰霉病的枯草芽孢桿菌還很少，且主要集中在番茄和草莓上的灰霉病防治上，因此用于防治黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌的研究就更少．本研究的目的是篩選出能夠抑制黃瓜上灰霉病菌的枯草芽孢桿菌菌株，為開發防治黃瓜灰霉病的微生物殺菌劑奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 寄主植物

黃瓜為津優黃瓜一號，由湖州市種子市場上購買．

1.1.2 菌株

41株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)，由浙江東奇生物科技有限公司提供．病原指示菌為黃瓜灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)，由浙江化工院有限公司生物測試中心提供．

1.1.3 培養基

NA培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂15，pH 7.0

發酵培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.0

PDA培養基(g/L)：土豆 200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH．

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發酵液制備

從斜面取1環挑取枯草芽孢桿菌于發酵培養基中，在回轉式搖床30,℃、220,r/min條件下培養1,d，制得種子液，并以2%接種量轉接到裝有90,mL液體發酵培養基的250,mL三角瓶中，在30,℃、220,r/min條件下發酵培養，獲得發酵液(含有菌體)備用．

1.2.2 發酵濾液的制備

將發酵液4,000,r/min 離心30,min，上清液經過0.22,μL膜過濾，濾除菌體，獲得無菌發酵上清液．

1.2.3 菌懸液的制備

將發酵液4,000,r/min 離心30,min，棄上清液，加入新鮮的NA培養基直至與原發酵液相同的體積．

1.2.4 灰霉菌菌塊的制備

在無菌條件下，取20,mL經滅菌后冷卻至45,℃左右的PDA培養基加入培養皿，制成PDA平板．放置24,h后，在平板中央接種灰霉菌菌絲，22,℃培養4,d．在已長好的灰霉菌平皿中，用直徑0.5,cm打孔器在菌落邊緣切取菌落圓塊，備用．

1.2.5 枯草芽孢桿菌對灰霉菌的抑制作用

用無菌水稀釋發酵液至菌體濃度為1×105,mL–1的稀釋液，其中枯草芽孢桿菌計數法采用的是顯微直接計數法．向放置1,d的PDA平板中加入100,μL的枯草芽孢桿菌發酵稀釋液，用涂布器涂勻，每個處理3個重復．將切取的灰霉菌菌塊接種在涂好的平板中央，有菌絲的一面接觸平板．25,℃培養4,d后，用直尺“十字交叉法”測量灰霉菌菌落直徑(單位為cm)，結果取其平均值．

1.2.6 枯草芽孢桿菌對黃瓜灰霉病的防治效果

選擇1片真葉期長勢一致的盆栽黃瓜苗，藥劑噴霧處理(以葉片滴下液滴為準)后自然晾干24,h，每個處理4個重復．用鑷子將菌塊接種在葉片中央，有菌絲的一面接貼于葉面．然后將黃瓜苗放在不同的濕盒中，25,℃下黑暗保濕24,h，再維持相對濕度90%左右、光暗周期(d/n)10,h/14,h下培養3,d．用直尺“十字交叉法”測病斑直徑(單位為cm)，結果取其平均值．

2 結果與分析

2.1 不同菌株枯草芽孢桿菌對灰霉菌的抑制效果比較

測試41株枯草芽孢桿菌發酵液(菌體濃度1× 105,mL–1)對灰霉菌的抑制作用．供試枯草芽孢桿菌發酵液對灰霉菌菌絲生長表現出不同程度的抑制作用．其中BS01、BS03、095802、095303、094510和142203菌株對灰霉菌菌絲生長的抑制作用達到了50%以上．BS01和BS03對灰霉菌菌絲生長的抑制效果與稀釋100倍的50%撲海因懸浮劑相當，抑菌率分別為64%和61%．

為了進一步確定初篩結果的可靠性，利用平板法對BS01、BS03、095802、095303、094510和142203菌株的發酵液進行復篩．共設3次獨立的重復實驗，每次實驗采用3個重復，取3個重復抑菌率的平均值作為1次實驗的分析值，結果見表1．

將自磨刃強化處理的刀片對稱安裝在鍘草機上,在3個月的秸稈(約40t)加工過程中，刀片沒有經過人為磨刀。刀片始終保持良好的銳利度(如圖7所示)，出現了不同程度的自磨刃效果。3種刀片不同程度上出現了崩刃現象，在崩刃的地方也出現自磨刃效果。不同滲層的刀片質量變化也有所不同，具體磨損質量如表5所示。磨損質量對比分析：

由表1可知，在3次重復實驗中，供試菌株的發酵液對灰霉菌菌絲生長均表現出較強的抑制作用，而且標準差在10%以內，重復性較好；在3次實驗中，各枯草芽孢桿菌的發酵液對灰霉菌菌絲生長的抑菌率趨勢基本一致，其中，BS01和BS03對灰霉菌菌絲生長的抑菌率為最高，分別為67.91%和65.45%．

表1 枯草芽孢桿菌發酵液對灰霉菌的抑制作用Tab. 1 Inhibition of Bacillus on Botrytis cinerea growing

2.2 復篩后的6株枯草芽孢桿菌對盆栽黃瓜灰霉病的防治效果

為了驗證平板法篩選出的菌株發酵液在植物活體上對病原菌的抑制效果，以盆栽黃瓜苗為寄主植物，檢測BS01、BS03、095802、095303、094510和142203發酵液對黃瓜灰霉病的防治效果，結果見表2.

表2 枯草芽孢桿菌對黃瓜灰霉病菌的防治效果Tab. 2 Efficacies of Bacillus against gray mold on cucumber leaves

從表2中可以看出，枯草芽孢桿菌發酵液對溫室盆栽黃瓜灰霉病的抑制作用低于平皿實驗中對灰霉病菌的抑制效果．095802、095303和142203發酵液在植物活體實驗中對灰霉病沒有防治作用，094510有29.73%的抑制效果；BS01和BS03仍然保持對黃瓜灰霉病一定的抑制作用，抑菌率分別為47.62%和53.44%．

2.3 菌株BS01和BS03對灰霉菌菌絲的抑制作用

分別稀釋BS01和BS03的發酵液至菌體濃度為108、107、106、105、104、103、102,mL–1，采用涂布平板法測試不同的菌體濃度的發酵液對黃瓜灰霉菌菌絲的抑制作用．

由圖1可知隨發酵液中菌體濃度的降低，發酵液對灰霉菌菌絲生長的抑制作用減弱，其中BS01發酵液對灰霉菌抑制作用的下降趨勢比BS03明顯．另外，當菌體濃度為103,mL–1時，菌株BS03和BS01抑菌率仍在50%左右．

圖1 菌株BS01和BS03對黃瓜灰霉菌菌絲的抑制作用Fig. 1 Efficacies of BS01 and BS03 on Botrytis cinerea growing

表3 菌株BS01和BS03對灰霉菌菌絲生長的影響(自由度f＝6)Tab. 3 Effects of BS01 and BS03 on Botrytis cinerea growth

由表3可知，當抑菌率為50%時，BS03的菌體濃度低于BS01的菌體濃度，因此BS03抑菌效果比BS01的抑菌效果好．

2.4 菌株BS03發酵濾液、菌懸液的抑菌活性

發酵濾液易于加工劑型，新鮮的培養基在加工劑型中具有保護菌體的作用；因此，研究發酵濾液和菌懸液的抑菌活性具有一定的意義．

將發酵液、發酵濾液、菌懸液稀釋1、2、5、10、20倍，以發酵液作對照，比較菌懸液和發酵濾液對灰霉病的防治效果，結果如圖2所示．菌懸液、發酵濾液對灰霉病的防治效果隨其濃度的降低而降低，說明發酵濾液和菌懸液在防治灰霉病中起到一定作用．其中，當發酵濾液稀釋10倍和稀釋20倍時，發酵濾液對灰霉病幾乎沒有防治作用；稀釋20倍時的防治效果反而比稀釋10倍時的防治效果更好，這可能是由于誤差作用．菌懸液對灰霉病的防治效果高于發酵濾液，說明選擇菌懸液防治黃瓜灰霉病優于發酵濾液.

圖2 發酵液、菌懸液、發酵濾液對黃瓜灰霉病菌的防治效果Fig. 2 Efficacies of fermentation liquid，bacterial suspendsion，supernatant against gray mold on cucumber

2.5 病原菌的接種時間對抑菌活性的影響

在測試發酵液、發酵濾液、菌懸液防治效果實驗中，菌懸液表現出較高的防治效果，僅次于發酵液．考察菌懸液處理黃瓜苗后，在不同時間接種灰葡萄孢菌，其對灰霉病的防治效果如圖3所示．

圖3 病原菌接種時間對防治效果的影響Fig. 3 Control efficacy of different intervals after treatment

由圖3可知，用菌懸液處理3,d后接種病原菌，對灰霉病的防治作用最高，表現良好的防病效果，其防效達63.92%．可能是由于菌體的定殖能力和菌體對營養物質的快速利用抑制了葡萄孢菌的生長，從而達到防治灰霉病的作用．

3 討 論

芽孢桿菌是土壤和植物微生態區系的優勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用．許多優良的天然菌株已成功地用于防治植物病害．Bacon等[4]分離的玉米內生枯草芽孢桿菌與病原串珠鐮孢菌有相同的生態位，枯草芽孢桿菌能在玉米體內迅速定殖和繁殖，有效降低串珠鐮孢菌及毒素的積累．Papavizas等[5]報道，枯草芽孢桿菌可以防治水稻等作物的多種土傳真菌病．Hwang等[6]報道，枯草芽孢桿菌可以防治豌豆的根腐病．20世紀90年代后，國外許多枯草芽孢桿菌制劑上市．日本東京技術研究所的枯草芽孢桿菌RB14和NB22分別對Rhizoctonia solani、Fusarium orysporum和Pseudornonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效[7]．至2001年，美國已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株，QST713、GBO3、MBI600和FZB24均獲得了美國環保署(EPA)商品化或有限商品化生產應用許可[8]．我國一些科研人員也對具有生防作用的枯草芽孢桿菌進行了研究．王雅平等[9]采用室內平皿實驗、盆栽和田間小區實驗確定枯草芽孢桿菌A014菌株對小麥赤霉病的防效達50.6%，之后他們從絲瓜根際土壤分離到枯草芽孢桿菌TG26菌株[10]．該菌株對小麥赤霉病和西瓜枯萎病有較強的抑制作用，對小麥赤霉病的盆栽防效達89.8%，對西瓜枯萎病的苗期防效達100%．田間小區實驗表明，對小麥赤霉病、西瓜枯萎病的防效分別為73.1%和79.6%，并且有明顯的增產效應．張學君等[11]用枯草芽孢桿菌B3菌株防治小麥紋枯病，田間防效為50%～80%，并確定了它在小麥根系及莖基部的定殖能力．

本研究采用涂布平板法和盆栽植株法測定了枯草芽孢桿菌發酵液對灰霉菌菌絲的抑制作用．比較兩種方法的結果，篩選出防治黃瓜灰霉病效果較好的菌株BS03．

盆栽植株法對灰霉菌的防治效果低于涂布平板法的抑菌效果．產生這個結果的原因有三點：一是環境因素的影響．因為盆栽植株法測定是在活體植株的葉片上，外界環境影響菌株的生長繁殖以及菌株之間可能產生相互作用．二是枯草芽孢桿菌的作用機理為與病原菌競爭營養和空間，對病原菌產生拮抗作用或對植物的誘導作用等．因此，枯草芽孢桿菌在植物葉片上的定植、在葉片上接種病原菌的時間、枯草芽孢桿菌的發酵時間、發酵液的pH等對枯草芽孢桿菌的抑菌效果影響很大．而涂布平板法是病原菌和枯草芽孢桿菌之間的作用，相對來說影響因素少．三是供試樣品僅為發酵液而不是制劑化產品，其在葉片上的黏附性及穩定性需要助劑來增強．

菌株BS03發酵液具有較強的抑菌作用，室內盆栽植株實驗的防病效果在50%以上，對田間實驗具有一定的意義．另外用新鮮的培養基重新懸浮菌體后表現出良好的抑菌效果，新鮮培養基既可以為菌體生長繁殖和代謝提供營養物質，還可以在制造劑型過程和貯存過程中保護菌株．說明BS03菌懸液可將作為微生物源殺菌劑進行深入研究．

［1］王文靜. 我國生物農藥的現狀與發展建議[J]. 赤峰學院學報：自然科學版，2010，26(6)：152-153.

［2］阮云飛，穆瑞霞，王吉慶，等. 放線菌F24發酵液對灰霉菌拮抗作用初探[J]. 河南農業科學，2008(11)：84-87.

［3］趙達，傅俊范，裘季燕，等. 枯草芽孢桿菌在植病生防中的作用機制與應用[J]. 遼寧農業科學，2007(1)：46-48.

［4］Bacon C W，Yates I E，Hinton D M，et al. Biological control ofFusarium moniliformein maize [J]. Environmental Health Perspectives，2001，109(S2)：325-332.

［5］Papavizas G C，Lumsden R D. Biological control of soilborne fungal propagules[J]. Annual Review of Phytopathology，1980，18：389-413.

［6］Hwang S F，Chakravartyp P. Potential for the integrated control ofRhizoctoniaroot rot ofPisumsativumusingBacillussubtilisand a fungicide[J]. Journal of Plant Diseases and Protection，1992，99(6)：626-636.

［7］Asaka O，Shoda M. Biocontrol ofRhizoctoniasolani damping-off of tomato withBacillus subtilisRB14[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62(11)：4081-4085.

［8］Office of Pesticide Program：biopesticide[DB/OL]. 2001，http：//www. epa. gov/ pesticides/ biopesticides.

［9］王雅平，劉伊強，潘乃穟，等. 枯草芽孢桿菌A014菌株防治小麥赤霉病的初步研究[J]. 生物防治通報，1992，8(2)：54-57.

［10］王雅平，劉伊強，潘乃穟，等. 枯草芽孢桿菌TG26防病增產效應的研究[J]. 生物防治通報，1993，9(2)：63-68.

［11］張學君，趙軍，王金生. 枯草芽孢桿菌B3菌株對小麥根系和莖基部的定殖作用研究[J]. 生物防治通報，1994，10(4)：171-174.

責任編輯：郎婧

Screening Bacillus subtilis against Botrytis cinerea on Cucumber and Preliminary Studies of its Inhibition Activities

LI Limei1,2，GAO Bingli2，LIU Dong1,2，LI Xinglin1
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Zhejiang Dongqi Biotech Co. Ltd.，Huzhou 313000，China)

By the combination of in-vitro plate assay and in-vivo leaf assay，the biocontrol activity of 41 Bacillus subtilis strains in-vitro over mycelial growth of B. cinerea，as well as their controlling efficacies over gray mold on cucumber leaves in pots were evaluated，so as to screen the strains which could inhibit the mycelial growth of B. cinerea. The results indicated that B. subtilis BS01 and BS03 were identified to have the strongest ability to control the cucumber gray mold. While the cell concentration of both BS01 and BS03 had 50% of effect in plate assay，the cell concentration of BS03 was lower. But BS03 appeared to have better effect. The controling efficacy of BS03 in-vivo leaf assay revealed that the cell suspension displayed a higher control efficacy than supematant. The cell suspension was used on cucumber leaves. After two days，the pathogen was inoculated，and the inhibition activity was then the highest.

gray mold；biopesticides；Bacillus subtilis

Q939.96

：A

：1672-6510(2012)03-0010-05

2011–10–21；

2012–02–08

李麗梅（1985—），女，河北邢臺人，碩士研究生；通信作者：李興林，副教授，lxlszf@tust.edu.cn.