二氯化鈷致人結腸癌細胞系CacyBP/SIP核轉位

謝福利，仇長青，趙盈盈，楊 博，馮珊珊，翟惠虹*

(1.寧夏師范學院醫學院，寧夏固原756000;2.寧夏醫科大學臨床學院總醫院消化內科，寧夏銀川750004)

低氧在結腸癌發生過程中具有重要的作用［1］，可促進結腸癌細胞增殖、抑制凋亡及增強化療耐藥［2］，但具體機制不清。CacyBP/SIP自1996年發現以來，越來越多的證據顯示［3］:在腫瘤發生、發展、侵襲及轉移等方面都有重要的作用;同時，具有依賴Ca2+濃度的核轉位現象［4］，核轉位后促進結腸癌細胞增殖［5］。低氧是否可誘導CacyBP/SIP核轉位?本研究擬通過構建CacyBP/SIP過表達慢病毒顆粒，轉染至結腸癌細胞，給予 CoCl2刺激，觀察CacyBP/SIP在結腸癌細胞中的定位。

1 材料與方法

1.1 材料

結腸癌細胞SW480(上海中科院);CoCl2(Sigma公司);胞質胞核蛋白抽提試劑盒(Pierce公司);CacyBP/SIP mAb(Cell signaling公司);293T細胞、pGC-LV重組載體、pHelper 1.0和pHelper 2.0(吉凱基因公司);其他相關試劑(Fermentas、SinoBio、Takara、NEB、捷瑞公司)。

1.2 方法

1.2.1 過表達CacyBP/SIP慢病毒載體構建:應用人結腸癌細胞系HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0軟件設計上游和下游引物，用PCR法擴增CacyBP/SIPcDNA序列。帶有綠色熒光的慢病毒載體與目的基因分別用NheⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，T4連接酶將酶切后的產物相連，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，應用PCR法篩選陽性克隆，接種陽性轉化子，送測序。用 Lipofectamine2000共轉染pGC-LV載體和兩種輔助包裝原件載體至293T細胞包裝。培養8h更換為完全培養基，培養48 h后，收集上清液，濃縮后在293T細胞中采用逐孔稀釋法測定并標定病毒滴度。

1.2.2 轉染結腸癌細胞:常規培養傳代，在T50瓶細胞長至30% ～50%時，每瓶加入500 μL(5 mg/L)Polybrene、4 400 μL完全培養基和100 μL(1 ×108個細胞)過表達CacyBP/SIP的慢病毒顆粒，放入培養箱培養8～12 h棄去細胞上清，更換為新鮮培養基繼續培養。至細胞長至80%以上匯合時，正常消化傳代并行激光共聚焦檢測。

1.2.3 激光共聚焦檢測:取3個12孔培養板，每孔放置一個細胞爬片，每孔接種(3～4)×104個細胞。至細胞長至最佳狀態時，吸干培養基，用PBS沖洗2次，分別加入2 mL含 50、100 及150 μmol/L CoCl2培養基。對照組每孔分別加入完全培養基作為對照。分別在培養箱培養0.5和1 h。用4%多聚甲醛1 mL，固定20 min，PBS沖洗3遍，再用0.1%的 Tritont 100，37℃溫箱內打孔45 min，PBS沖洗3遍，最后用含DAPI封片劑染色封片。激光共聚焦檢測CacyBP/SIP在細胞中的定位。

1.2.4 Western blot法檢測:對于激光共聚焦檢測陽性結果(100 μmol/L CoCl2刺激1 h)，胰蛋白酶消化后以500 r/min離心3 min，取細胞沉淀用胞質蛋白、核蛋白抽提試劑盒分別抽提胞質、胞核蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量;上樣緩沖液稀釋至5 g/L、煮沸后 －80℃凍存;把20 μL蛋白樣品上樣到12%SDS-PAGE膠加樣孔內，電泳電壓80 V，時間20 min;濕式轉膜，電流200 mA，60 min;加入5%脫脂牛奶封閉60 min后，加入 CacyBP/SIP單抗(1∶200)4℃孵育過夜，常規洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2 000)的二抗，室溫孵育1 h，洗滌。曝光、顯影。

2 結果

2.1 構建了過表達CacyBP/SIP慢病毒載體

PCR擴增目的基因(圖1);對構建的過表達CacyBP/SIP慢病毒載體陽性克隆進行PCR鑒定(圖2)，與目標基因測序比對(圖3);繪制熔解曲線(圖4)。

2.2 轉染結腸癌SW480細胞

將過表達CacyBP/SIP的慢病毒顆粒，轉染至結腸癌SW480細胞，復感染指數(MOI)為20，96 h后激光共聚焦觀察到綠色熒光(圖5)。

2.3 激光共聚焦檢測CoCl2刺激前、后CacyBP/SIP在細胞內的定位

無CoCl2刺激條件下 CacyBP/SIP主要位于細胞胞質內;給予100 μmol/L CoCl2刺激0.5 h，CacyBP/SIP位于胞質;刺激1 h時觀察到CacyBP/SIP轉位至胞核(圖6)。

2.4 Western blot檢測CoCl2刺激前、后CacyBP/SIP在細胞內的定位

無刺激條件下，CacyBP/SIP主要在胞質內表達，給予100 μmol/L CoCl2刺激1 h，可在細胞核內表達(圖7)。

3 討論

圖7 CoCl2刺激前、后 Western blot檢測CacyBP/SIP在胞質及胞核中的表達Fig 7 The expressions of CacyBP/SIP in cytoplasm and nuclear under the detecting by Western blot before and after the stimulation of CoCl2

CacyBP/SIP分子質量約26 ku，含一個687 bp的開放閱讀框，編碼228個氨基酸，存在7個磷酸化位點和1個核定位信號［6］。其功能主要與紅細胞的發育［7］和新的泛素-蛋白酶體降解有關［8］。與腫瘤的關系以往研究發現，CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐藥細胞中高表達并參與胃癌細胞多藥耐藥，其下調可以部分逆轉耐藥性［9］。近年來又發現CacyBP/SIP參與乳腺癌、胰腺癌的發生發展及復發轉移，可能成為預后不良的生物學指標之一［10－11］。因此推斷CacyBP/SIP與惡性腫瘤的發生發展密切相關。

在前期研究中利用淋巴細胞雜交瘤技術制備了3株CacyBP/SIP單克隆抗體，對正常及腫瘤組織中表達研究發現［12］:CacyBP/SIP在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，在正常結腸組織不表達，且主要定位于胞質及胞核。

CacyBP/SIP具有依賴 Ca2+濃度的核轉位現象［13］。那么，究竟哪些因素可以引起 CacyBP/SIP核轉位?

人體腫瘤存在低氧的假設從上世紀50年代年提出，80年代得到證實。腫瘤中的低氧表現為不穩定性。后多家研究證實低氧在結腸癌發生過程中都具有重要作用［14］:低氧可促進結腸癌細胞增殖、凋亡抑制、增強化療耐藥、遷移能力增強。Co2+是鐵螯合酶的底物，可替代氧感受器血紅素中的Fe2+，在高濃度時與氧結合，將此分子鎖定在脫氧合狀態，使細胞在不缺氧的環境下“感覺”缺氧。因此本研究用CoCl2刺激來模擬結腸癌低氧，觀察低氧狀態下CacyBP/SIP是否發生核轉位?

本研究通過CacyBP/SIP過表達慢病毒載體轉染至結腸癌SW480細胞，激光共聚焦顯微鏡發現CacyBP/SIP主要位于胞質，Western blot亦證實其位于胞質。給予不同濃度CoCl2，人為制造細胞低氧刺激，發現低氧時，CacyBP/SIP可發生核轉位現象，Western blot亦證實CacyBP/SIP在刺激前位于胞質，刺激后部份位于胞核。

蛋白在細胞中的定位常常與其功能密切相關，很多蛋白分子從無活性形式變為活性形式時，會發生分子定位的變化，進入到特定的亞細胞結構中發揮其功能。CacyBP/SIP在給予刺激后發生核轉位及磷酸化，提示其可能做為信號分子傳遞信息，從而參與細胞功能的調節。前期已發現CacyBP/SIP在結腸癌中高表達，免疫組化結果提示CacyBP/SIP位于胞漿及胞核，低氧可誘導CacyBP/SIP核轉位，CacyBP/SIP是否做為信使，傳遞上游促進惡性腫瘤增殖的信號，需進一步研究。

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