杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶在真核細胞中的表達*

崔柳青，張 璐，張 磊，薛樂勛#

1)河南工業大學生物工程學院鄭州450001 2)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州450001

杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶在真核細胞中的表達*

崔柳青1，2)，張 璐1)，張 磊2)，薛樂勛2)#

1)河南工業大學生物工程學院鄭州450001 2)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，研究方向:腫瘤與生物工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;葡萄糖-6-磷酸異構酶;真核細胞;表達

目的:分別構建杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構酶(DsGPI)綠色熒光蛋白表達載體和真核表達載體。方法:PCR擴增得到上、下游分別添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的DsGPI基因，雙酶切后與綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1連接，得到重組載體pEGFP-C1-DsGPI，轉染狗腎細胞MDCK，觀察綠色熒光蛋白在細胞中的定位;同理將上、下游分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的DsGPI基因與真核表達載體pcDNA3.1(+)連接，得到pcDNA3.1-DsGPI，轉染食管癌EC9706細胞，分別應用RT-PCR法和Western blot法檢測DsGPI mRNA和蛋白的表達。結果:DsGPI在MDCK細胞中定位于細胞核，在EC9706細胞中被有效表達。結論:成功構建了DsGPI的綠色熒光蛋白表達載體和真核表達載體。

葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)是在糖代謝過程中起重要作用的一種酶，其催化葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸之間的相互轉化，并普遍存在于原核和真核生物中。近年來的研究證實，GPI是一種非常保守的酶［1］，不僅參與機體內的糖代謝，而且還具有一些其他作用［2］，如在動物細胞中作為自分泌運動因子(AMF)促進腫瘤細胞增殖浸潤［3］。在藻類細胞中GPI可能參與了鞭毛相關功能的執行［4］，而藻類鞭毛已被作為研究鞭毛/纖毛與疾病的一種模型［5］。目前對杜氏鹽藻GPI尚未有深入研究的報道，其作為鞭毛相關蛋白是否與其他鞭毛相關蛋白一樣在真核細胞中發揮作用，是否也能影響一些疾病尤其是腫瘤都很值得探討。該研究構建了杜氏鹽藻GPI(DsGPI)的綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1-DsGPI和真核細胞表達載體 pcDNA3.1-DsGPI，研究 DsGPI在狗腎細胞MDCK中的定位，并觀察其在食管癌EC9706細胞中的表達，為進一步探討其在真核細胞中的生物學功能提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與質粒 MDCK細胞購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)，真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司，EC9706細胞、真核綠色熒光表達載體pEGFP-C1、人GPI綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1-GPI、人GPI真核表達載體pcDNA3.1-GPI和大腸桿菌DH5α均由該研究室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 LA Taq DNA聚合酶，限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及反轉錄試劑盒均購自大連寶生物公司;無內毒素質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司;T4 DNA連接酶購自Promega公司;轉染試劑脂質體2000、RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司;RPMI 1640培養液購自Gibco公司;兔抗人GPI抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗DsGPI多抗由該研究室制備保存，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 引物 根據DsGPI全序列，設計用于構建綠色熒光表達載體的一對引物:F1(5’-CCGGAAT TCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和 R1(5’-CGCGGATCCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，同理設計用于構建真核表達載體的一對引物F2(5’-CGCGGATCCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和R2(5’-CCGGAATTCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，在其上下游分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。設計用于半定量RT-PCR的引物，見表1。引物由北京博尚生物技術有限公司合成。

表1 用于RT-PCR的引物序列

1.2 pEGFP-C1-DsGPI和 pcDNA3.1-DsGPI的構建

1.2.1 杜氏鹽藻cDNA的合成 取對數生長期的鹽藻細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA。取5 μg RNA作模板，加入反轉錄試劑盒中的隨機引物并使總反應體積為20μL。70℃變性5min后迅速冰浴，依次加入4μL 反應緩沖液，2μL dNTP混合物，1μL RNase inhibitor，37 ℃ 5min 后加入 1μL MMLV逆轉錄酶，37℃ 60min，70℃10min，結束反應。

1.2.2 PCR擴增 取上述逆轉錄產物cDNA為模板，分別用引物F1和 R1、F2和R2進行PCR擴增。反應體系:cDNA 模板 1μL，10 × Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各 0.25μL，LA Taq DNA聚合酶 0.25μL，無菌水 18.75μL。反應條件:95℃預變性5min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，30個循環;72℃延伸5min;4℃終止反應。

1.2.3 載體的構建及鑒定 用EcoRⅠ、BamHⅠ分別雙酶切PCR產物、pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果后回收、純化目的片段，將基因片段分別與對應的載體片段經16℃過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質粒并行雙酶切鑒定，得綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1-DsGPI和真核細胞表達載體pcDNA3.1-DsGPI。將初步鑒定正確的菌液送北京博尚生物技術有限公司測序以確定讀碼框是否正確。

1.3 pEGFP-C1-DsGPI在MDCK細胞中的定位將EMEM培養基粉末溶于1 L三蒸水中，加入5 g NaHCO3，混合均勻調整酸堿度至 pH 7.2 ～ 7.4，0.22 μm濾膜過濾，4℃儲存備用。用含體積分數10%胎牛血清及雙抗的EMEM完全培養基培養MDCK細胞，細胞培養條件為體積分數5%CO2、37℃。培養至細胞密度達80%左右時，嚴格按脂質體2000的說明書無菌技術操作要求，轉染pEGFP-C1-DsGPI。以轉染pEGFP-C1、pEGFP-C1-GPI的細胞為對照。轉染24 h后，熒光顯微鏡下通過藍光激發觀察EGFP在細胞中的分布。

1.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 細胞中的表達①EC9706細胞用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基培養。培養至細胞密度達80%左右時，分別轉染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI和空載體 pcDNA3.1(+)，轉染方法同 1.3。轉染后 12、24、48 和72 h分別收集細胞并提取RNA，進行PCR擴增，檢測DsGPI mRNA。②根據RT-PCR結果，確定轉染最佳時間，收集細胞并提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳，電轉蛋白到硝酸纖維素膜上，用GPI抗體及DsGPI多克隆抗體進行Western blot分析，暗室曝光顯色。

2 結果

2.1 DsGPI cDNA全長的擴增 用Trizol試劑提取杜氏鹽藻細胞總RNA，電泳顯示為18 S、28 S兩條帶，紫外分光光度計測定A(260 nm)/A(280 nm)≥1.8，說明其純度和完整性符合 RT-PCR要求。RT-PCR擴增出DsGPI cDNA全長，電泳結果顯示片段長度與NCBI登錄的杜氏鹽藻DsGPI cDNA長度一致(圖1)。

圖1 DsGPI基因全長的RT-PCR檢測結果

2.2 DsGPI表達載體的鑒定 重組表達載體pcDNA3.1-DsGPI和 pEGFP-C1-DsGPI分別經 EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，電泳出約2 kb的DNA條帶，說明目的基因DsGPI已經插入對應載體中(圖2)。經測序，插入片段長度正確且讀碼框無誤。

2.3 DsGPI在MDCK細胞中的定位 轉染空質粒pEGFP-C1的MDCK細胞綠色熒光分布整個細胞，而轉染pEGFP-DsGPI和pEGFP-GPI的MDCK細胞綠色熒光均定位于細胞核區域。

2.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 細胞中的表達轉染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI的 EC9706細胞中GPI和DsGPI mRNA的表達水平均較未轉染和空載體轉染細胞升高，并且在24 h時升高最明顯(圖3)。收集轉染后24 h的細胞進行Western blot分析，結果顯示轉染 pcDNA3.1-GPI和 pcDNA3.1-DsGPI的EC9706細胞中GPI和 DsGPI均能被有效表達，且表達水平高于未轉染和空載體轉染細胞(圖4)。

圖4 EC9706細胞轉染24 h后目的蛋白的表達情況

3 討論

越來越多的證據表明，鞭毛/纖毛異常與腫瘤等疾病的發生發展密切相關［6］，并且以萊茵衣藻為模式生物已經進行了一系列鞭毛/纖毛與重要疾病因子的關系的研究［7］。DsGPI是鹽藻鞭毛相關蛋白，深入研究DsGPI對腫瘤細胞的影響具有重要意義。哺乳動物細胞中GPI是個復雜的多功能蛋白，它不但參與糖酵解和糖異生等糖代謝過程，還具有以下功能，促進人類髓細胞性白血病細胞和B細胞的成熟，促進胚胎脊柱生長，參與精子凝集和神經發育等，而最重要的是其能作為自分泌運動因子促進腫瘤細胞的運動［8］。因此，深入研究DsGPI的功能首先要使其在真核細胞中穩定表達。

DsGPI的關鍵酶活位點以及預測的三維結構都跟人GPI一致［9］，但研究DsGPI與人GPI生物學功能上的差異需要更多證據。該實驗通過綠色熒光蛋白表達載體證實DsGPI在MDCK細胞中的定位和人的GPI定位非常相似:集中在細胞核區域，在胞質其他部位也有分布。這是因為與GPI相互作用的底物大多分布在內質網和線粒體上［10］，而細胞核周圍的內質網和線粒體中分布有較多的GPI底物，大量的熒光融合蛋白與底物結合使得此區域綠色熒光富集。該研究初步證明了DsGPI能在MDCK細胞中的細胞核區域表達和定位，這為在其他細胞中研究DsGPI功能提供了可行性依據。該研究中作者構建了DsGPI的真核表達載體pcDNA3.1-DsGPI，并證實該載體可在食管癌EC9706細胞中有效表達，這為深入研究其在真核細胞中的功能奠定了基礎。

［1］ Grauvogel C，Brinkmann H，Petersen J.Evolution of the glucose-6-phosphate isomerase:the plasticity of primary metabolismin photosynthetic eukaryotes［J］.Mol Biol Evol，2007，24(8):1611

［2］ Munjral N，Gupta AK，Kaur N.Studies on glucose metabolizing enzymes in cytosolic and bacteroidal fractions of mungbean(Vigna radiata L.)and lentil(Lens culinaris L.)nodules ［J］.Indian J Biochem Biophys，2007，44(3):186

［3］ Chiu CG，St-Pierre P，Nabi IR，et al.Autocrine motility factor receptor:a clinical review［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2008，8(2):207

［4］ Jia Y，Xue L，Li J，et al.Isolation and proteomic analysis of the halotolerant alga Dunaliella salina flagella using shotgun strategy［J］.Mol Biol Rep，2010，37(2):711

［5］ Pan J，Naumann-Busch B，Wang L，et al.Protein phosphorylation is a key event of flagellar disassembly revealed by analysis of flagellar phosphoproteins during flagellar shortening in Chlamydomonas［J］.J Proteome Res，2011，10(8):3830

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［9］ Cui L，Xue L，Li J，et al.Characterization of the glucose-6-phosphate isomerase(GPI)gene from the halotolerant alga Dunaliella salina［J］.Mol Biol Rep，2010，37(2):911

［10］Fairbank M，St-Pierre P，Nabi IR.The complex biology of autocrine motility factor/phosphoglucose isomerase(AMF/PGI)and its receptor，the gp78/AMFR E3 ubiquitin ligase［J］.Mol Biosyst，2009，5(8):793

(2012-03-28收稿 責任編輯王 曼)

Expression of Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase in eukaryotic cells

CUI Liuqing1，2)，ZHANG Lu1)，ZHANG Lei2)，XUE Lexun2)
1)College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001 2)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;glucose-6-phosphate isomerase;eukaryotic cell;expression

Aim:To construct Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase(DsGPI)green fluorescent protein expression vector and eukaryotic expression vector.Methods:The complete cDNA sequences of DsGPI was cloned into the plasmid pEGFP-C1 to create a recombinant plasmid pEGFP-C1-DsGPI by using BamHⅠ and EcoRⅠ sites and identified.Localization of the EGFP fusion proteins was examined by fluorescence microscopy after the recombinant plasmids were transfected in MDCK cells.Recombinant plasmids pcDNA3.1(+)-DsGPI were constructed with the same method and transfected in EC9706 cells，DsGPI mRNA was detected by RT-PCR and DsGPI protein were examined by Western blot.Results:EGFP fusion proteins were mainly localized in the nucleus area in MDCK cells and expression of DsGPI increased in EC9706 cells.Conclusion:DsGPI green fluorescent protein expression vectors and eukaryotic expression vectors has been constructed successfully.

Q781

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.003

*國家自然科學基金資助項目 31000580