重組表達乙肝病毒x蛋白的腺病毒構建及在HepG2細胞的表達*

張紅飛，李軍鋒，戶 義，張慧娜，鮑春旸，王凱娟#，周育森

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室鄭州450001 2)軍事醫學科學院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室北京100071

重組表達乙肝病毒x蛋白的腺病毒構建及在HepG2細胞的表達*

張紅飛1，2)，李軍鋒2)，戶 義2)，張慧娜1)，鮑春旸2)，王凱娟1)#，周育森2)

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室鄭州450001 2)軍事醫學科學院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室北京100071

#通訊作者，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:腫瘤流行病學，E-mail:kjwang@163.com

腺病毒載體;HBx基因;肝癌細胞

目的:構建重組表達HBx的腺病毒，并通過感染細胞建立HBx高表達的細胞模型。方法:首先將HBx基因插入腺病毒穿梭質粒pAdTrack中，限制性酶切鑒定正確后將其用PmeⅠ酶切線性化，轉到BJ5183感受態細菌進行同源重組，重組后的腺病毒載體pAd-HBx經PacⅠ酶切線性化后，轉染到QBI-293A細胞中，根據EGFP的表達判斷重組腺病毒的包裝情況。RT-PCR鑒定重組腺病毒的HBx基因表達。根據GFP的表達檢測病毒滴度和感染效率。將病毒感染人肝癌HepG2細胞，48 h后收集裂解細胞，Western blot檢測HBx蛋白的表達。結果:重組腺病毒載體pAd-HBx經酶切鑒定確認構建成功。將pAd-HBx轉染到QBI-293A細胞，熒光檢測提示病毒獲得成功包裝，RT-PCR檢測到細胞中HBx基因的表達。重組病毒感染人肝癌HepG2細胞，Western blot檢測到HBx蛋白表達。結論:成功構建了攜帶HBx基因的重組腺病毒，感染肝癌HepG2細胞后檢測到了HBx蛋白的表達，提示建立了HBx高表達的細胞模型，為后續的HBx的功能研究奠定了基礎。Military Medical Sciences，Beijing 100071

乙肝病毒x(HBx)蛋白是乙肝病毒致肝細胞癌變的重要相關分子［1］，具有多種生物學功能，可通過反式激活作用調節基因的轉錄，與宿主細胞的多種蛋白相互作用［2］，調控宿主細胞基因表達，進而影響宿主細胞的信號轉導、細胞增殖與分化和細胞凋亡、蛋白降解過程及遺傳穩定性［3-5］等。為了深入研究HBx的功能，建立HBx多種高表達的細胞模型和(或)小鼠模型，進而研究HBx參與調控的信號通路，作者構建了HBx的重組腺病毒載體，經過包裝得到高滴度的HBx重組腺病毒，并用其感染肝癌HepG2細胞，檢測HBx表達，為深入研究HBx的生物學功能提供所需的材料。

1 材料與方法

1.1 材料 腺病毒載體系統 pAdTrack、含pAdEasy-1載體的 BJ5183細菌、HepG2細胞、QBI-293A細胞以及空腺病毒均來自該教研室;含HBV1.3的pAAV-HBV1.3載體由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所譚文杰教授惠贈;pMD18-T載體系統購自TaKaRa公司;DH5α感受態、DNA標準Marker、小量質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司;限制性內切酶PmeⅠ、PacⅠ購自NEB公司;胎牛血清、高糖型DMEM培養液(C12430)購自Gibco公司;PMSF購自Amresco公司;HBx多克隆抗體為作者先期使用原核表達的HBx蛋白免疫大耳白兔所制備;HRP標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Western blot顯色試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 重組表達HBx腺病毒的制備

1.2.1 重組穿梭質粒pAdTrack-HBx載體的構建和鑒定 設計 HBx編碼基因擴增的引物 P1:5’-AAGCTTGCCACGATGGCTGCTAGGTTG-3’，P2:5’-TTATGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3’，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;以pAAV-HBV1.3為模板，PCR擴增HBx的編碼基因，擴增產物大小為474 bp。擴增產物進行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因片段，連接入pMD18-T克隆載體，在含氨芐青霉素平板上培養選取單克隆菌落，擴增后，提取質粒進行序列測定(由北京奧科鼎盛生物科技公司完成)，將序列正確的克隆以HindⅢ和SmaⅠ酶切，回收HBx基因片段后連接入經HindⅢ和EcoRⅤ酶切回收的pAdTrack載體中。挑取卡那霉素選擇性培養基篩選的陽性克隆，提取質粒，使用BamHⅠ進行酶切鑒定(正確重組載體應含有3個BamHⅠ位點，其中一個為pAdTrack載體所含有的位點，另外一個為HBx編碼區N端所含有的位點，第3個位點為pMD18-T-HBx載體編碼下游T載體所含有的位點)。正確的克隆被切開為3條帶，其中5 171 bp和3 885 bp為載體片段，468 bp為含HBx的目的片段，正確克隆命名為pAdTrack-HBx。

1.2.2 HBx重組腺病毒載體的構建 將上述構建的穿梭質粒pAdTrack-HBx使用PmeⅠ酶切線性化后轉化入含腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的BJ5183感受態細菌中。卡那霉素選擇性培養基篩選陽性克隆，挑取10個菌落較小的克隆擴增培養，依據文獻［6］使用快速裂解法初步篩選重組克隆。選擇2個DNA條帶最大的克隆，提取質粒，轉化入DH5α感受態擴增質粒，用PacⅠ酶切鑒定質粒，切下3.0 kb或4.5 kb條帶的克隆載體，為正確重組的表達HBx腺病毒載體克隆，命名為pAd-HBx重組載體。

1.2.3 細胞培養和轉染 QBI-293A細胞及HepG2細胞培養于DMEM培養基。培養基中添加體積分數10% 胎牛血清(FBS)，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，體積分數5%CO2、37℃恒溫孵箱培養。按Lipofectamine 2000說明書進行轉染。

1.2.4 pAd-HBx重組腺病毒的包裝和滴度測定pAd-HBx重組質粒經PacⅠ酶切后，回收大片段后轉染入QBI-293A細胞，轉染6～8 d后，在熒光顯微鏡下監測細胞綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，如果細胞中的綠色熒光充滿視野則說明重組腺病毒載體在細胞中包裝成病毒。收集包裝后的細胞，一部分加入1 mL的DMEM培養液重懸細胞，－70℃/37℃反復凍融3次裂解細胞，離心后取含病毒的上清液－70℃保存。一部分以未包裝細胞和空腺病毒感染細胞為陰性對照，用Trizol法提取RNA，逆轉錄得到cDNA，以pMD18-T-HBx為陽性對照，PCR擴增鑒定HBx的轉錄表達。取重組病毒和空腺病毒上清液再次感染QBI-293A細胞進行病毒擴增，經過3次擴增，倍比稀釋病毒上清并感染細胞，以感染細胞GFP陽性數目計算病毒滴度以及感染復數(MOI)。

1.3 重組表達HBx腺病毒在HepG2細胞中表達的Western blot檢測 接種2孔(2.5×105個/孔)HepG2細胞于6孔板中，用含體積分數10%FBS的DMEM培養液37℃培養18 h，吸去細胞培養基，每孔加新鮮培養基500μL，并按MOI為20的標準加入重組腺病毒(表達HBx的腺病毒和空病毒對照)，吸附1 h后，加入1.5 mL培養液繼續培養，感染72 h后，熒光顯微鏡檢測含綠色熒光的腺病毒是否感染HepG2。收集細胞，冰上裂解30min，進行SDSPAGE電泳，然后電轉移至PVDF膜上，轉移后的膜于封閉液中封閉，先后與前期制備的抗-HBx多克隆抗體(按1∶2 000稀釋)和HRP標記的山羊抗兔IgG(按1∶10 000稀釋)共孵育，洗膜后，加入化學發光劑ECL，在暗室中曝光，顯影，定影，在膠片上獲得相應的條帶，分析結果。

2 結果

2.1 重組表達HBx的腺病毒構建結果

2.1.1 穿梭載體pAdTrack-HBx的構建 HBx擴增產物電泳結果如圖1A所示，回收PCR產物連接入pMD18-T載體中，鑒定連接成功后，進行序列測定，結果與GenBank序列完全一致。HBx片段連接入pAdTrack載體中應用BamHⅠ酶切鑒定結果如圖1B，切開大小與理論一致，證明HBx被正確連接入pAdTrack載體中，命名為pAdTrack-HBx。

2.1.2 pAdTrack-HBx與pAdEasy的同源重組 穿梭載體pAdTrack-HBx與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1在BJ5183感受態細菌中同源重組后的質粒用PacⅠ酶切鑒定結果如圖1C，切下4.5 kb大小的條帶。符合腺病毒說明書穿梭質粒與骨架載體重組后的酶切特征，說明含HBx基因的腺病毒載體pAd-HBx重組成功。

圖1 重組表達HBx腺病毒的構建

2.1.3 重組腺病毒在QBI-293A細胞內的包裝、擴增和鑒定 將經PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒質粒pAd-HBx轉染到QBI-293A細胞后第8天后，檢測到綠色熒光充滿視野中的絕大多數細胞，提示病毒已經包裝成功。以未感染以及感染空腺病毒感染QBI-293A細胞為對照，RT-PCR結果為HBx重組腺病毒細胞組擴增出HBx基因，而對照的未感染細胞以及空腺病毒感染細胞未擴增出HBx基因(圖2)。

圖2 RT-PCR結果

2.2 HBx重組腺病毒在HepG2中的表達 將擴增的HBx重組腺病毒和對照空腺病毒感染HepG2細胞72 h后熒光顯微鏡觀測細胞中GFP的表達，結果可見視野中細胞GFP的表達，說明HepG2細胞被腺病毒成功感染。Western blot方法檢測感染病毒后的2組細胞HBx蛋白的表達，發現空載體感染細胞組不表達HBx蛋白，而HBx重組腺病毒感染細胞組表達HBx蛋白(圖3)。

圖3 HepG2細胞感染后HBx表達的Western blot檢測

3 討論

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率第二位。乙肝病毒感染是引起肝癌的主要原因之一。乙肝病毒編碼的x蛋白是一種反式作用因子，它通過增強各種轉錄和調控因子的表達影響肝細胞的增殖和凋亡，在原發性肝癌的發生發展中發揮重要的作用［7］。

該研究在前期實驗中發現了多種可能受到HBx調控表達的基因，為了從多方面驗證HBx的過表達調節靶基因的通路，擬建立HBx的多種高表達細胞系，為此構建了pCDNA3.1-HBx載體，然而瞬時轉染細胞的效率不高，不能產生均一、高效表達HBx的細胞系。如果使用穩定轉染的方法，則存在建立周期長，整合位點不確定，表達效率不均一等缺點。考慮到腺病毒具有感染效率高，宿主廣泛，容易制備表達，不整合入染色體，表達效率高等優點，作者構建了HBx重組腺病毒載體，并將構建的病毒載體轉染后，成功組裝成表達HBx的腺病毒，使用制備的病毒感染肝細胞HepG2，熒光檢測可見細胞全部受到感染，而普通的質粒瞬時轉染HepG2效率僅能達到10%～30%。通過Western blot檢測病毒感染后的細胞裂解液，證明HBx在HepG2得以高效表達，說明作者制備的重組腺病毒可以在HepG2細胞中高效均一地表達HBx蛋白。

總之，該實驗成功構建了HBx腺病毒載體，包裝得到表達HBx蛋白的腺病毒，制備的腺病毒可以高效感染HepG2細胞，高效表達HBx，為后續HBx功能的深入研究奠定了基礎。

［1］ Hong A，Han DD，Wright CJ，et al.The interaction between hepatitis B virus X protein and AIB1 oncogene is required for the activation of NFκB signal transduction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012 May 22［Epub ahead of print］

［2］ Martin-Vilchez S，Lara-Pezzi E，Trapero-Marugán M，et al.The molecular and pathophysiological implications of hepatitis B X antigen in chronic hepatitis B virus infection［J］.Rev Med Virol，2011 Jul 14.doi:10.1002/rmv.699［Epub ahead of print］

［3］盧宏柱，周建華.乙型肝炎病毒X蛋白通過激活細胞外蛋白調節激酶轉導機制上調大鼠系膜細胞腫瘤壞死因子-α的表達［J］.實用兒科臨床雜志，2009，24(10):738

［4］ Srisuttee R，Koh SS，Kim SJ，et al.Hepatitis B virus X(HBX)protein upregulates β-catenin in a human hepatic cell line by sequestering SIRT1 deacetylase［J］.Oncol Rep，2012，28(1):276

［5］劉凱歌，高紅艷，趙慧，等.HBx和VEGF與乙肝相關性肝癌組織血管生成及轉移的關系［J］.吉林大學學報:醫學版，2010，36(2):372

［6］范晶，梁梓，伏秦超，等.一種經濟、簡便和準確鑒定重組質粒的方法［J］.生物技術，2010，20(3):54

［7］ Benhenda S，Cougot D，Buendia MA，et al.Hepatitis B virus X protein molecular functions and its role in virus life cycle and pathogenesis［J］.Adv Cancer Res，2009，103:75

(2011-10-16收稿 責任編輯趙秋民)

Construction and expression of recombinant HBx-expressed adenovirus and HBx expression in HepG2

ZHANG Hongfei1，2)，LI Junfeng2)，HU Yi2)，ZHANG Huina1)，BAO Chunyang2)，WANG Kaijuan1)，ZHOU Yusen2)
1)Department of Epidemiology，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of

adenovirus vector;HBx gene;hepatoma cell

Aim:To construct recombinant HBx-expressed adenovirus，and establish a cell culture model with highlevel HBx expression by infection.Methods:HBx gene was cloned into the shuttle vector pAdTrack.After confirmed by restriction digestion，the resultant plasmid was linearized by digestion with PmeⅠ and was subsequently transformed into competent E.coli cells BJ5183 for homologous recombination.The recombination vector pAd-HBx was linearized with PacⅠ and transfected into QBI-293A cells.The packing of adenovirus was determined by the expression of EGFP.The expression of HBx gene in recombinant adenovirus was identified by RT-PCR.Viral titer and infection efficiency of adenovirus were detected according to the expression of GFP.HepG2 cells were infected by recombinant adenovirus.Forty-eight hours later，cells were collected and lysed to detect the expression of HBx protein by Western blot.Results:Restriction digestion showed that the recombinant adenovirus vector pAd-HBx was successfully constructed.After pAd-HBx transfected into QBI-293A cells，fluorescence detection indicated that the adenovirus was successfully packed.The expression of HBx gene was detected by RT-PCR.After infection to the hepatoma HepG2 cells，the expression of HBx protein was detected by Western blot.Conclusion:The recombinant adenovirus expressing HBx gene has been successfully constructed.After infecting HepG2 cell，the HBx protein expression is detected，suggesting cell culture model with high-level expression of HBx is established.

R575.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.008

*國家自然科學基金青年科學基金資助項目 30900753