亞健康狀態大鼠的神經－免疫－內分泌機制的研究

徐孝平，潘永明，劉瑞敏，壽旗揚，賈臨超，周衛民，朱科燕，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

亞健康狀態大鼠的神經－免疫－內分泌機制的研究

徐孝平，潘永明，劉瑞敏，壽旗揚，賈臨超，周衛民，朱科燕，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

目的 探討亞健康狀態大鼠的神經－免疫－內分泌的機制。方法 取雄性SPF級Wistar大鼠36只，按體重隨機分成6組，即多因素組(MF)、多因素干預組(MFT)、熱水游泳組(WS)、睡眠不足組(SD)、單純束縛組(PC)和正常對照組(C)，每組6只。分別采用熱水游泳、飲食限制、睡眠剝奪、束縛等方式建立亞健康大鼠模型，多因素干預組每日經口給予300 mg/kg的抗衰老片，在造模5 d后處理動物，并取大鼠血，分別測定血清5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3和 T4、睪酮(T)、皮質酮(CORT)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、白介素 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8和IFN－γ含量以及T淋巴細胞亞群的變化，并取脾臟測定 T、B淋巴細胞增殖能力和 NK細胞活性變化。結果(1)與正常對照組比，①造模結束后多因素組大鼠血清5－HT明顯降低(P＜0.05)，而熱水游泳組和單純束縛組5－HT含量卻升高顯著(P＜0.01)，且睡眠不足組和單純束縛組血清DA含量降低顯著(P＜0.05);同時各亞健康模型大鼠的血清T3、T4、CORT和ACTH含量均顯著升高(P＜0.01)，T/C比值降低顯著(P＜0.01)，且睡眠不足組血清T降低明顯(P＜0.05);②造模結束后多因素組的大鼠IL－8含量降低顯著(P＜0.01)，而熱水游泳組和單純束縛組 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量以及睡眠不足組 IL－1β、IL－2、IL－6 含量均顯著升高(P ＜ 0.05，P ＜0.01)，同時顯著降低各亞健康模型大鼠淋巴細胞增殖轉化能力和 T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值和NK細胞活性(P＜0.05，P＜0.01)。(2)與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組大鼠血清 DA含量明顯升高(P＜0.05)，并能顯著提高機體 T淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+數目和 CD4+/CD8+比值(P＜0.01)，降低血清CORT含量。結論 亞健康狀態能引起大鼠HPA軸反應性失衡，皮質醇釋放過度，引起內分泌的紊亂，并能引起淋巴細胞功能降低，出現明顯機體免疫抑制現象;而抗衰老片具有抗應激，提高T細胞免疫功能，改善情緒和內分泌紊亂的作用，從而達到改善亞健康體質的目的。

神經遞質;免疫;內分泌;亞健康;淋巴細胞亞群;抗衰老片

隨著社會科技不斷發展，人們的生活節奏的日益加快和社會競爭日趨激烈，人們遭受的情緒應激逐漸增多，嚴重影響了人們的生活質量和工作效率。世界衛生組織(WHO)提出，亞健康狀態是健康與疾病之間的臨界狀態［1］，全球調查結果顯示，全世界真正健康的僅占5%，確診有疾病的占20%，而75%則處于亞健康狀態。在美國醫學界已將亞健康與艾滋病一起列為21世紀人類健康的最大敵人［2］。

目前認為亞健康狀態是由于心理、生理、社會三方面因素導致機體的神經系統、內分泌系統、免疫系統整體協調失衡、功能紊亂而致，而亞健康發生發展的主要因素包括不良的生活方式和習慣、精神過度緊張和不良的心理因素刺激、環境污染的不良影響以及機體的生物學因素(個性特征和遺傳因素)有關［3］。我們前期已根據亞健康形成的主要原因，采用單純束縛、熱水游泳、部分睡眠剝奪和飲食不節等造模因素復制亞健康狀態大鼠模型，研究發現亞健康狀態大鼠出現明顯的心理因素的改變和疲勞等癥狀，胸腺系數的明顯降低則表明亞健康狀態具有免疫抑制的現象，且氧化應激亦參與亞健康的形成過程。可見，機體的神經系統、內分泌系統、免疫系統整體協調失衡、功能紊亂可能是亞健康形成的主要機制。為證實亞健康狀態神經－免疫－內分泌的作用機制，本研究對亞健康狀態大鼠的神經遞質、內分泌激素和免疫指標進行了觀察，探討亞健康狀態大鼠的神經－免疫－內分泌軸變化情況，為亞健康狀態的生理病理機制的深入研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級Wistar大鼠，體質量為150 g～170 g，36只，購于中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物公司［SCXK(滬)2007－0005］，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障系統內［SYXK(浙)2008－0115］，環境溫度為(23 ±1)℃，相對濕度為50%～65%，飼喂全價營養顆粒飼料，自由飲水。

1.2 主要儀器與試劑

BIO－Rad 酶標儀(美國 BIO－Rad 公司)，蔡司ZEISS熒光倒置顯微鏡(蔡司公司)，Thermo CO2細胞培養箱(Thermo公司);Epics Altra流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司);5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3、T4、睪酮(T)、皮質酮(CORT)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、白介素 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 試劑盒由 Bio－rad 公司提供，RPMI－1640培養基購自 Gibco，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，四甲基偶氮哩藍(MTT)、刀豆蛋白 A(ConA)均為進口分裝，PMS購自SIGMA，淋巴細胞分離液購自上海恒信化學試劑有限公司，NAD、INT 均購自 Amresco，YAC－1 細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。抗衰老片由正大青春寶藥業有限公司提供(批號:080320)。CD3+，CD4+，CD8+試劑盒:CD3+:FITC標記，CD4+:PE標記，CD8+:PE標記，均由美國eBioscience公司生產;紅細胞裂解液，杭州聯科生物技術有限公司生產。

1.3 動物分組及處理方法

所有大鼠適應性飼養一段時間后，按體重隨機分成6組，即多因素(熱水游泳、睡眠剝奪、飲食限制等因素)組、多因素藥物干預組、熱水游泳組、睡眠不足組、單純束縛組和正常對照組，每組6只。各組分別作以下造模處理:(1)多因素組(multifactor group，MF):大鼠每天上午 8∶00在水溫 43℃ ±0.5℃的水槽中游泳3 min，之后迅速撈起并擦干身體，放回飼養籠，在上午9∶00～19∶00將大鼠放置睡眠剝奪裝置中剝奪睡眠10 h，隨后放回飼養籠中，并在晚上19∶00加入足量的普通飼料，暴食1 h，20∶00取出剩余飼料，連續 5 d;(2)多因素干預組(multifactor treatment group，MFT):造型方法與多因素組相同，并于每天上午7∶50給予300 mg/kg抗衰老片浸膏粉，連續5 d;(3)熱水游泳組(warm swimming group，WS):每天上午8∶00在水溫(43±0.5)℃的水槽中游泳3 min，之后迅速撈起并擦干身體，放回飼養籠;上午8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，連續5 d;(4)睡眠不足組 (sleep deficiency group，SD):每天 9∶00～19∶00 睡眠剝奪10 h;上午8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，連續 5 d;(5)單純束縛組(purely constraint group，PC):每天下午 14∶00～17∶00放于自制束縛桶里限制大鼠活動3 h，連續5 d;(6)正常對照組(control group，C)即不處理:每天上午 8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，正常飼養。所有動物造模處理5 d后麻醉處死。亞健康大鼠模型的確定:經血生化、組織病理等檢查，均未發現亞健康狀態大鼠出現明顯的病理變化，但大鼠已表現出精神萎靡、疲勞、反應遲鈍、活力減退等。

1.4 指標觀察

1.4.1 大鼠神經遞質、內分泌和免疫指標的測定:大鼠麻醉后，腹主靜脈取血，離心，分離血清，采用ELISA 法 測 定 血 清 5－HT、DA、T3、T4、T、CORT、ACTH、IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量。

1.4.2 T、B淋巴細胞增殖能力測定:無菌條件下取大鼠的脾臟，加適量 Hank＇s液研磨，以200目不銹鋼網濾過，1 500 r/m離心 5 min，棄上清液，加Hank＇s液重復洗滌2次。收集脾細胞，加適量RPMI 1640培養液混懸，以0.4%臺盼蘭拒染法計數，活細胞數不小于95%，加RPMI 1640完全培養液稀釋，并調整細胞濃度至1×107個/mL。于96孔微量板中，每孔加100 μL脾細胞懸液(1×107cell/mL)和等體積的 ConA溶液(終濃度為 5 μg/mL)、LPS溶液(終濃度為10 μg/mL)或 RPMI1640培養液，重復3孔。另設空白對照組。37℃、5%CO2培養44 h后，各孔加入50 μL MTT溶液(2 mg/mL)，繼續培養4 h。1 000 r/min離心5 min，棄去各孔上清液，分別加150 μL酸性DMSO溶液，振蕩，于室溫暗處放置15 min，以酶標儀于波長578 nm處測定A值，并按下式計算刺激指數(SI):SI(刺激指數)=加有絲分裂原培養物的A值/不加有絲分裂原培養物的A值。

1.4.3 NK細胞活性測定:實驗前24 h將靶細胞YAC－1傳代培養，應用前以 Hank＇s液洗 3 次，用RPMI 1640完全培養液調整細胞濃度為2×105個/mL。無菌取脾，制備脾細胞懸液，用 Hank＇s液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液將細胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水裂解紅細胞，20 s后再加入0.5mL 2倍Hanks液及8mL Hanks液，離心10 min(1 000 r/min)，用 1mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數，調整細胞濃度為1×107個/mL。將靶細胞加入 96 孔培養板，每孔 100 μL，試驗孔加入 100 μL脾細胞(效靶比50∶1)，自然釋放孔加入100 μL培養液，最大釋放孔加入 100 μL 2%NP40，37℃培養4 h，離心，取上清液100 μL置96孔酶標板中，加入LDH 基質液 100 μL，反應 8 min，以 30 μL 1mol/L 的HCl終止反應，在酶標儀492 nm處測定A值。

NK細胞活性(%)=(反應孔A－自然釋放孔A)/(最大釋放孔A－自然釋放孔A)×100%

1.4.4 T淋巴細胞亞群測定:取血加抗體，大鼠眼眶取血1mL，用EDTAk3血常規管抗凝全血，試管標號;取50 μL抗凝全血，分別加入試管①、試管②，直接加至底部，且不可觸壁;試管①統一加5 μL抗體CD3+和 5 μL 抗體 CD4+，試管②統一加 5 μL 抗體CD3+和5 μL抗體 CD8+，用振蕩器混勻后暗室放置20～30 min，使抗體與血樣充分結合;避光常溫30 min后，加裂解液:試管在振蕩中加入500 μL裂解液，在30℃水浴中放置15 min，使細胞充分裂解，達到透亮;裂解后，1 500 r/min離心5 min，倒去上清液，用PBS液洗兩遍，加1mL PBS液，1 500 r/min離心5 min，后倒去上清液;再加1mL PBS液，1 500 r/min離心5 min;離心后倒去上液;加500 μL PBS液，再用Epics Altra流式細胞儀檢測。

1.5 數據統計學處理

2 結果

2.1 亞健康模型大鼠血清5-HT和多巴胺含量的變化

與正常對照組比，造模5 d后多因素組的大鼠血清5－HT和 DA含量均出現降低，其中血清5－HT降低顯著(P＜0.05)，而熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清5－HT含量均出現升高和DA含量的降低，且以熱水游泳組和單純束縛組升高5－HT含量顯著(P＜0.01)，同時，睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清DA含量均顯著降低(P＜0.05);與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組大鼠具有升高5－HT含量和DA含量的作用，其中DA升高顯著(P＜0.05)，見表1。

另外，與正常對照組比，造模5d后多因素組、熱水游泳組、睡眠不足組、單純束縛組大鼠的血清T3、T4均明顯升高(P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組的大鼠T3、T4含量均有降低趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)，見表1。

2.2 亞健康模型大鼠血清睪酮(T)、皮質酮(CORT)和促腎上腺皮質激素(ACTH)含量的變化

與正常對照組比，造模5 d后，各亞健康模型大鼠的睪酮T含量出現降低，其中睡眠不足組降低顯著(P＜0.05)，同時各亞健康模型大鼠伴有皮質酮CORT和促腎上腺皮質激素ACTH含量的顯著升高(P＜0.01)，且引起T/C比值降低顯著(P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組能升高T、T/C和降低CORT含量的趨勢(P＞0.05)，見表2。

2.3 亞健康模型大鼠血清 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ含量的變化

與正常對照組比，造模5d后多因素組的大鼠IL－1β、IL－2、IL－6 有上升趨勢，但 IL－8 和 IFN－γ 含量均有所降低，其中IL－8含量降低顯著(P＜0.01)，而熱水游泳組和單純束縛組的大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含 量均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，睡眠不足組的大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6 含量均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，而 IL－8 和 IFN－γ 含量雖有升高，但差異不顯著(P＞0.05);抗衰老片干預后多因素干預組與多因素組和正常對照組比差異均不顯著(P＞0.05)，見表3。

表1 各組亞健康模型大鼠血清5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3、T4含量的變化(x±s，n=6)Tab.1 The changes of 5－HT，DA，T3and T4contents in the sub－health rats(x±s，n=6)

表2 各組亞健康模型大鼠血清T、CORT、T/C和ACTH含量的變化(±s，n=6)Tab.2 The changes of T，CORT，T/C and ACTH contents in the sub－health rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別Groups 睪酮(T)(ng/mL)皮質酮(CORT)(ng/mL)睪酮/皮質酮T/C 促腎上腺皮質激素(ACTH)(pg/mL)多因素組(MF)10.48±2.66 273.05±53.37＊＊ 0.04±0.02＊＊ 198.14±25.17＊＊09多因素干預組(MFT)11.98±5.49 243.34±44.67＊＊ 0.05±0.02＊＊ 205.08±51.38＊＊熱水游泳組(WS)8.51±1.62 168.38±17.72＊＊ 0.05±0.02＊＊ 174.82±65.28＊＊睡眠不足組(SD)6.90±1.18* 225.15±77.78＊＊ 0.03±0.01＊＊ 167.63±30.15＊＊單純束縛組(PC)9.35±2.50 301.29±80.05＊＊ 0.03±0.01＊＊ 206.22±94.00＊＊正常對照組(C)13.18±4.24 31.91±13.81 0.42±0.27 56.68±28.

表3 各組亞健康模型大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量的變化(±s，n=6)Tab.3 The changes of IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8 and IFN－γ contents in the sub－health rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別 Groups IL－1β(pg/ml)IL－2(pg/ml)IL－6(pg/ml)IL－8(pg/ml)IFN－γ(pg/ml)多因素組(MF)183.03±6.76 336.79±16.72 329.96±36.19 601.14±58.37＊＊.97±94.87 605.09±92.44 528.46±57.12多因素干預組(MFT)200.17±26.80 341.36±44.17 300.45±47.67 685.49±128.02 575.58±89.98熱水游泳組(WS)220.80±22.54＊＊ 390.48±31.74＊＊ 390.06±43.40＊＊ 884.55±34.97* 722.29±65.04*睡眠不足組(SD)210.47±17.11＊＊ 386.30±40.98* 379.35±36.16＊＊ 836.94±75.75 636.27±66.62單純束縛組(PC)218.42±18.64＊＊ 434.01±50.35＊＊ 439.05±26.25＊＊ 940.79±68.82＊＊ 751.44±100.10*正常對照組(C)173.24±10.90 320.27±34.45 289.74±32.64 759

2.4 亞健康模型大鼠NK細胞、淋巴細胞增殖轉化能力的變化

與正常對照組比，造模5 d后各亞健康模型大鼠NK細胞均有所下降，其中多因素組、多因素干預組、睡眠不足組、單純束縛組降低顯著(P＜0.05，P＜0.01);而各亞健康模型大鼠淋巴細胞增殖轉化能力均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組的大鼠NK細胞、淋巴細胞增殖轉化能力均有所上升，但差異不顯著(P ＞0.05)，見表4。

表4 各組亞健康模型大鼠NK細胞、淋巴細胞增殖轉化能力的影響(± s，n=6)Tab.4 The changes of NK cells and lymphocyte proliferation ability in the sub－health rats

表4 各組亞健康模型大鼠NK細胞、淋巴細胞增殖轉化能力的影響(± s，n=6)Tab.4 The changes of NK cells and lymphocyte proliferation ability in the sub－health rats

注:與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;多因素組與多因素干預組比，#P＜0.05，##P＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

Groups NK% ConA LPS多因素組(MF)41.08±6.07＊＊ 1.72±0.22＊＊ 1.05±0.03組別＊＊62.20±11.16 2.42±0.46 1.19±0.11多因素干預組(MFT)42.61±16.58* 1.81±0.12＊＊ 1.06±0.02＊＊熱水游泳組(WS)46.83±9.98 1.62±0.10＊＊ 1.06±0.04＊＊睡眠不足組(SD)36.61 ±5.43＊＊ 1.79 ±0.21＊＊ 1.06 ±0.06＊＊單純束縛組(PC)32.26±6.69＊＊ 1.99±0.32* 1.08±0.04*正常對照組(C)

2.5 各亞健康模型大鼠T淋巴細胞亞群的變化

與正常對照組比，造模5 d后各亞健康模型大鼠T淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值顯著降低(P＜0.01)，而CD8+與正常對照組差異無顯著性(P＞0.05);與多因素組比，抗衰老片干預后多因素干預組的 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值顯著升高(P＜0.01)，見表5。

表5 各組亞健康模型大鼠T淋巴細胞亞群的變化(± s，n=6)Tab.5 Changes of T lymphocyte subpopulations in the sub－health rats

表5 各組亞健康模型大鼠T淋巴細胞亞群的變化(± s，n=6)Tab.5 Changes of T lymphocyte subpopulations in the sub－health rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared to control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別Groups CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+多因素組(MF)51.65±5.91＊＊ 31.88±4.12＊＊ 19.67±1.87 1.62±0.14＊＊73.37±1.19 51.48±1.20 19.42±1.62 2.67±0.23多因素干預組(MFT)74.98±4.78## 52.20±4.66## 20.90±1.52 2.50±0.19##熱水游泳組(WS)64.90±2.60＊＊ 43.60±1.57＊＊ 19.67±1.64 2.23±0.15＊＊睡眠不足組(SD)63.10±2.58＊＊ 42.27±2.70＊＊ 19.10±0.60 2.21±0.14＊＊單純束縛組(PC)65.22±4.07＊＊ 43.32±2.70＊＊ 20.13±1.46 2.15±0.07＊＊正常對照組(C)

3 討論

亞健康態是介于健康與疾病兩個狀態之間，是穩態的相對失衡的狀態，此時，神經、內分泌、免疫系統呈現一定紊亂，自主調節能力降低，人體出現疾病癥狀，但物理生化檢查往往難以發現明顯體征異常。已有研究發現，5－HT是中樞及外周神經系統的重要神經遞質，且在調節機體的情緒方面具有相當重要的作用，但5－HT對HPA軸的調節作用，目前尚存在爭議。已有研究表明5－HT的增加對失眠、精神狀態、感知能力和肌肉疲勞程度等都可能產生影響，5－HT活性增強可能與慢性疲勞綜合征有關［4］;相反，亦有研究認為抑郁狀態、抑郁癥時人體內 5－HT 含量顯著降低［5］，詹向紅等［6］的研究發現憤怒應激能使5－HT水平降低。本實驗結果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清5－HT含量明顯升高，而多因素組的大鼠血清5－HT含量則顯著降低，均可表明各亞健康狀態大鼠的情緒出現明顯的變化，且5－HT含量變化趨勢的不同可能與應激程度和因素有關。另外，本研究結果亦顯示，各亞健康狀態大鼠的血清DA含量均明顯降低，DA作為一種中樞神經遞質，也參與調控精神活動，研究表明，在反復長期心理應激情況下，能使大量的DA被耗竭，最終導致 DA含量的降低［5］，而DA活性的降低，可使肌肉活動的協調能力降低，導致疲勞加劇，可見，各亞健康狀態的大鼠出現明顯的情緒波動和疲勞狀態，提示亞健康狀態能引起單胺類神經遞質的異常，可能是亞健康狀態的生理病理機制之一。

現代醫學研究表明，下丘腦－垂體－腎上腺皮質(HPA)軸能調控促腎上腺皮質激素、腎上腺糖皮質激素(GC)的分泌，進而影響與應激有關的行為、神經內分泌免疫活動，慢性心理應激可使血液中皮質酮持續升高，引起血液中糖皮質激素積累，造成內分泌代謝過分增加［7］。甲狀腺激素 T3、T4是反映甲狀腺功能的重要指標，本實驗結果顯示，各亞健康狀態的大鼠血清甲狀腺激素 T3、T4以及皮質酮(CORT)和促腎上腺皮質激素(ACTH)含量升高，睪酮(T)含量降低，引起T/CORT比值的降低，提示亞健康狀態能引起下丘腦－垂體－甲狀腺軸、下丘腦－垂體－腎上腺皮質軸和下丘腦－垂體－性腺軸功能紊亂，使甲狀腺激素、皮質酮與睪酮分泌異常，導致內分泌代謝出現紊亂。但CORT的分泌又可以反饋抑制ACTH和促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)的生成，形成了HPA軸的環行調節通路，但在應激的作用下，上述負反饋抑制效應減弱，從而出現ACTH和CORT的分泌增加，導致 HPA軸功能的亢進［8］，從而使亞健康大鼠產生緊張、焦慮、憤怒或抑郁的情緒變化和行為改變，以及免疫力和記憶能力的下降等。

心理神經免疫學的研究表明，心理應激因素可通過影響中樞神經和內分泌系統來改變機體的免疫能力。結果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ活性均顯著升高，而多因素組的大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6 活性有上升趨勢，但 IL－8 和 IFN－γ 活性均有所下降，從以上結果顯示各亞健康狀態大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6 活性的升高，可能是由于亞健康狀態形成過程中體內發熱和骨骼肌的損傷，使得 IL－1β升高，參與刺激肌肉蛋白質的分解代謝。也有研究表明，IL－1β和 IL－6除了參與調節免疫功能外，對機體的代謝功能亦有密切的聯系［9，10］。IL－1β 作用于HPA軸引起 CORT分泌增加，促進血糖升高的作用［11］，這與我們前面所研究的各亞健康大鼠血糖升高較為一致，表明亞健康狀態大鼠的血清 IL－1β濃度增加主要是促進 CORT分泌以升高血糖，Albert Moraska［12］認為機體處于應激狀態時，IL－1β 濃度的增加對免疫功能也有抑制作用。IL－2主要由淋巴細胞亞群 TCD4+和 TCD8+產生，NK細胞和 LAK細胞也可產生，IL－1β 亦能促進 T 細胞產生 IL－2［7］，而亞健康狀態大鼠血清 IL－1β活性升高促進 IL－2升高;另外，由于HPA軸調節激活 T細胞分泌 IL－2，且在亞健康形成過程中皮質酮大量的釋放亦會導致IL－2升高。IL－6是一種致炎因子，由Th2細胞分泌，參與介導體液免疫功能，在炎癥和感染時生成和釋放增加。Nukina等［13］研究表明束縛應激可通過中樞和外周兒茶酚胺升高血漿IL－6的活性水平，亦有報道認為運動時的血漿細胞因子，尤其是IL－6主要來源于收縮的骨骼肌細胞，而不是免疫細胞，并認為運動過程中肌肉產生的 IL－6 有免疫抑制作用［9］，IL－6可通過促進腎上腺皮質分泌 CORT，使血糖升高。IL－8是一種由單核細胞、內皮細胞及巨噬細胞等產生的中性粒細胞激活蛋白，具有趨化和激活多形核白細胞作用，可升高細胞內 Ca2+的濃度等，研究發現IL－8在多器官功能障礙至衰竭的發展過程具有重要作用，并在創傷性疾病中機體IL－8活性明顯升高［14］，但張銀娥等［7］研究認為慢性心理應激大鼠血清IL－8活性明顯降低，本研究結果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清IL－8活性明顯升高，而采用多因素造模的大鼠血清IL－8活性明顯降低，可能與應激的程度和時間的不同，導致HPA軸反應性和皮質酮釋放程度的差異所致，但IL－8活性的變化可表明亞健康狀態形成過程炎癥反應參與其中。IFN－γ主要由 Th1細胞分泌，介導細胞免疫反應，能誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等MHCⅡ類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。因此，IFN－γ在細胞免疫中具有重要激活作用，有研究表明心理應激可引起循環血中 IFN－γ的升高［15］，本研究結果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清 IFN－γ活性均有所升高，證實各亞健康狀態大鼠出現明顯的心理應激變化，而盧莉等［16］研究認為慢性應激組小鼠血清中IFN－γ水平明顯下降，表明慢性應激可抑制Th1類細胞因子，使Th1/Th2的平衡向Th2偏移，從而引起機體的細胞免疫功能下降，導致機體的防御能力下降，而本研究的多因素組的大鼠血清IFN－γ活性亦出現下降趨勢，提示可能由于應激程度和時間的不同，導致其介導的HPA軸和交感神經系統(SNS)通路在不同的造模過程中起決定性因素有所不同。

另外，本研究采用脾淋巴細胞增殖實驗和 NK細胞釋放實驗進一步評估各亞健康狀態大鼠的免疫狀態，結果顯示，亞健康狀態的大鼠可抑制ConA、LPS誘導的脾細胞增殖反應;其中ConA誘導的脾細胞增殖反應可反映T細胞功能，LPS誘導的脾細胞增殖反應可反應B細胞的功能，表明亞健康狀態可引起T、B細胞功能的減退，提示細胞免疫和體液免疫功能降低;NK細胞釋放實驗結果亦顯示亞健康狀態的大鼠NK細胞活性顯著降低，即出現明顯的機體細胞免疫功能的降低。T細胞是機體內重要的免疫細胞，根據表面分子可分為 CD3+、CD4+、CD8+等，因此，機體內 CD3+、CD4+、CD8+數目的變化是機體免疫功能變化的重要標志，有研究表明，心理應激會引起機體 T細胞亞群的數目減少［17］。本研究結果顯示，各亞健康狀態大鼠 CD3+、CD4+數目明顯減少，CD8+數目變化不明顯，CD4+/CD8+比值顯著降低，表明亞健康狀態大鼠出現了明顯的免疫抑制，這與羅威和傅京麗等［18，19］報道臨床慢性疲勞綜合癥患者 CD3+、CD4+數目明顯減少較為一致。

抗衰老片是目前國內有較大知名度的抗衰老中成藥，具有抗氧化應激和提高免疫功能的作用［20－23］，本研究對多因素造模的大鼠采用抗衰老片干預后，結果顯示，多因素干預組的大鼠明顯升高血清DA，提高機體T淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+數目和CD4+/CD8+比值的作用，降低血清 CORT含量，提示抗衰老片具有抗應激，提高T細胞免疫功能，改善情緒和內分泌紊亂的作用。

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Study on the Mechanism of Neuro-Immuno-Endocrine System of Rats in Sub-Health State

XU Xiao－ping，PAN Yong－ming，LIU Rui－min，SHOU Qi－yang，JIA Lin－chao，ZHOU Wei－min，ZHU Ke－yan，CHEN Min－li
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center，Hangzhou 310053，China)

Objective To explore the mechanism of neuro－immuno－endocrine system of rats in sub－health state.Methods Thirty－six male SPF Wistar rats were randomly divided into six groups:multi－factor group(MF)，multifactor treatment group(MFT)，warm water swimming group(WS)，sleep deficiency group(SD)，purely constraint group(PC)and control group(C)，six animals in each group.Respectively，using warm water swimming，dietary restrictions，sleep deprivation and constraint to establish sub－health rat models，and daily orally administered 300 mg/kg anti－aging tablet in the MFT group.At 5 days after modeling，the levels of serum 5－HT，DA，T3，T4，T，CORT，ACTH，IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8，IFN－γ and T lymphocyte subsets were detected，and changes of T and B lymphocyte proliferation and NK cell activity in the spleen were also determined.Results(1)Compared with the control group，① Serum 5－HT in the MF group was significantly reduced(P ＜0.05)，while 5－HT in the WS and PC groups was significantly increased(P ＜0.01)，and the serum DA content in the SD and PC groups was significantly decreased(P ＜0.05).At the same time，the serum T3，T4，CORT and ACTH contents in each sub－health model rats were significantly increased(P ＜ 0.01)，T/C ratio was significantly decreased(P＜0.01)，and the serum T in the SD group was significantly lowered(P＜0.05);② Sserum IL－8 content in the MF group was significantly reduced(P ＜ 0.01)，while the serum IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8 and IFN－γ levels in the WS and PC groups，and IL－1β，IL－2 and IL－6 levels in the SD group were all significantly increased(P ＜0.05，P＜0.01)，and the lymphocyte proliferation and T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ratio and NK cell activity were significantly reduced in all sub－health model rats(P ＜0.05，P ＜0.01).(2)Compared with the MF group，the administration of anti－aging tablets induced significantly increased serum DA content in the MFT group(P ＜ 0.05)，and significantly improved the T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ratio(P ＜0.01)，and lowered serum CORT content.Conclusions Sub－health state can lead to imbalances of the rat HPA axis，excessive cortisol release，endocrine disorders，reduced lymphocyte function and immune inhibition，while anti－aging tablets have anti－stress effects，enhancing T cell immune function and ameliorating emotional and endocrine disorders，so as to achieve the purpose of improving the sub－healthy physique.

Neurotransmitter;Immune;Endocrine;Sub－health;Lymphocyte subsets;Anti－aging tablets;Rats

R33

A

1671－7856(2012)08－0033－07

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.008

2012－06－05

1.浙江省中醫“治未病”研究專項(中醫證候亞健康大鼠模型的建立及其比較學研究，2007WB022);2.受“浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目”資助。

徐孝平(1978－)，男，實驗師，研究方向:實驗動物與比較醫學。E－mail:xxp0001@126.com。

陳民利(1963－)，女，教授，碩導，研究方向:比較醫學。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn。