中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉小鼠免疫功能調節作用的比較

傅惠英，張利棕，壽旗揚，周衛民，屠 玨，陳民利

(1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，杭州 310053;2.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉小鼠免疫功能調節作用的比較

傅惠英1，張利棕2，壽旗揚2，周衛民2，屠 玨2，陳民利2

(1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，杭州 310053;2.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的 觀察中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠免疫功能的影響。方法 分別給予中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉后，測定觀察對小鼠碳粒廓清功能、遲發性變態反應、溶血素抗體、淋巴細胞增殖和NK細胞活性等的影響。結果 3.0 g/kg中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉可顯著提高小鼠吞噬指數和半數溶血值(P＜0.01)、顯著提高T、B淋巴細胞增殖能力(P＜0.01，P＜0.05)、顯著提高NK細胞活性(P＜0.05)，0.5～1.5 g/kg中國被毛孢都能顯著抑制小鼠耳廓腫脹(P＜0.01，P＜0.05)，同時還能抑制脾臟和胸腺增大(P＜0.01，P＜0.05)。結論 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉均具有免疫調節作用，而中國被毛孢免疫抑制及增強天然免疫系統作用要優于蝙蝠蛾擬青霉，而對適應性免疫系統增強作用蝙蝠蛾擬青霉優于中國被毛孢。

中國被毛孢;蝙蝠蛾擬青霉;小鼠;免疫功能調節

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是我國傳統滋補中藥材，但由于價格的昂貴及野生資源的枯竭，人們逐漸使用人工蟲草菌粉來替代天然冬蟲夏草。從上個世紀80年代起，我國研究人員陸續從天然冬蟲夏草中分離到多個菌種，文獻報道已有22個學名，涉及13個屬［1］。隨著分子生物學手段發展，越來越多的證據顯示中國被毛孢為冬蟲夏草的無性型［2～4］。但楊金玲等［5］發現冬蟲夏草除了中國被毛孢菌寄生外，還存在著蝙蝠蛾擬青霉等內寄生菌，進而認為冬蟲夏草功效可能歸因于中國被毛孢、蝙蝠蛾擬青霉及其它內寄生菌的不同代謝產物共同作用。因此，本文以天然冬蟲夏草作對照，分別觀察中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠免疫功能的影響，比較兩者在調節免疫功能方面的差異，為臨床使用提供依據。

1 材料

1.1 藥物和試劑

1.1.1 藥物:中國被毛孢(Hirsutella sinensis，HS)，黃色粉末;蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali，PH)，黃色粉末，均由杭州泰士生物科技有限公司提供。冬蟲夏草(Cordyceps sinensis，CS):產地青海玉樹，購自青海藥材公司，打粉并60目過篩。以上三種藥物避光干燥、常溫(25℃以下)保存，臨用前用生理鹽水溶解至所需濃度。

1.1.2 印度墨汁(080321，北京中西遠大);碳酸鈉(051109，上海虹光化工廠);二硝基氟苯(20081011，上海化學試劑公司);都氏試劑(031114，寧波慈城生化);刀豆素(20071001，sigma);脂多糖(024K4067，sigma);噻唑藍溶液(27196EJ，sigma);二甲基亞砜(20060607，無錫海碩生物);YAC－1細胞(中科院上海細胞所);綿羊紅細胞懸液(綿羊外頸靜脈取血，除去纖維蛋白，加入10倍量的保存液);補體(取5只豚鼠全血，分離出血清，將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30 min，離心取上清，－70℃保存)。

1.1.2 動物:SPF級 ICR小鼠，體重 18～22 g，雄性，210只，SPF級 BALB/c小鼠，體重 18～22 g，雄性，36只，由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供［生產許可證:SCXK(滬)2007－0005］。

1.1.3 儀器設備:半自動生化分析儀，荷蘭 Merck Vitalab Micro;FA1004型分析天平，上海天平儀器廠;TG－16型高速冷凍離心機，上海安亭科技儀器公司;725型－86℃低溫冰箱，美國 FORMA;128C－340型酶標儀:奧地利 CliniBio;CB－150型 CO2培養箱:德國Binder;ZEISS AXIOVERT 200倒置顯微鏡:德國ZEISS。

1.2 方法［6-8］

1.2.1 對小鼠體內碳粒廓清功能影響:取體重為18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按體重隨機分為7組，即正常對照組、模型對照組、HS低劑組(1.0 g/kgHS)、HS高劑組(3.0 g/kg HS)、PH 低劑組(1.0 g/kg PH)、PH高劑組(3.0 g/kg PH)和 CS組(1.0 g/kg CS)，每組10只，連續灌胃給藥7 d，每日一次。末次給藥24 h后，除正常對照組尾靜脈注射生理鹽水，其余各組小鼠尾靜脈注射稀釋4倍的印度墨汁(0.1mL/10g體重)，注入墨汁后 2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血10 uL，并立即將其加到1mL 0.1%Na2CO3溶液中。在600 nm波長處測OD值。取小鼠肝臟和脾臟，吸干臟器表面血污后稱重。計算吞噬指數 =(體重/肝脾重)×［(logOD2－logOD10)/(T10－t2)］1/3。

1.2.2 對二硝基氟苯誘導小鼠遲發型變態反應影響:取體重為18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按體重隨機分為7組，即正常對照組、模型對照組、HS低劑組(0.5 g/kg HS)、HS高劑組(1.5 g/kg HS)、PH低劑組(0.5 g/kg PH)、PH高劑組(1.5 g/kg PH)和CS組(0.5 g/kg CS)，每組10只，連續灌胃給藥13 d，每日一次，給藥第7天時致敏，小鼠腹部皮膚用脫毛(3cm×3cm)，用1%DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。致敏5 d后，用 DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊，攻擊后24 h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳廓。用打孔器取下直徑8mm的耳片，用分析天平精密稱重，并計算耳腫脹度，取脾臟和胸腺，稱重計算脾臟和胸腺指數。

1.2.3 對SRBC致小鼠溶血素抗體生成影響:取體重為18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按體重隨機分為7組，即正常對照組、模型對照組、HS低劑組(1.0 g/kg HS)、HS高劑組(3.0 g/kg HS)、PH 低劑組(1.0 g/kg PH)、PH高劑組(3.0 g/kg PH)和 CS組(1.0 g/kg CS)，每組10只，各組分別給予相應濃度的相應藥物，每日一次，連續給藥7 d，腹腔注射20%SRBC0.2mL免疫4 d后，小鼠眼眶取血，取血清用SA緩沖液稀釋500倍。將稀釋后的血清1mL置試管內，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL，補體1mL(用SA液按1∶8稀釋)。另設不加血清的對照管(以SA液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30 min后，冰浴終止反應。2000 r/min離心10 min。取上清液1mL，加都氏試劑 3mL，同時取 10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏試劑至4mL，充分混勻，放置10 min，于540 nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值，計算樣品管半數溶血值(HC50)，HC50=(樣品的吸光度值/SRBC半數溶血時的吸光度值)×稀釋倍數。

1.2.4 對小鼠脾淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性影響:取體重為18～22 g的雄性BALB/c小鼠36只，按體重隨機分為6組，即空白對照組、HS低劑組(1.0 g/kg HS)、HS高劑組(3.0 g/kg HS)、PH 低劑組(1.0 g/kg PH)、PH高劑組(3.0 g/kg PH)和 CS組(1.0 g/kg CS)，每組6只，連續給藥7 d后，進行脾淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性測定。

1.2.4.1 脾淋巴細胞增殖反應:小鼠無菌取脾于培養基中，搗碎，使細胞分散均勻，過濾，離心，去上清，培養液洗滌2次。脾細胞制成10×106個/mL，布板:96孔板每孔加細胞200 μL，每一樣重復4孔，同時設立空白對照。樣品孔加 ConA2.5 μg/mL或LPS5.0 μg/mL，對照孔不加，37℃ 5%CO2培養箱中培養 72 h。加入 MTT 10 μL，繼續培養 4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜 150 μL，充分振蕩，于 570 nm測OD值。計算刺激指數:刺激指數 =加 ConA或LPS細胞孔的平均OD值÷對照孔的平均OD值。

1.2.4.2 NK細胞活性檢測:取 YAC－1靶細胞和效應細胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入96孔培養板中;靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100 μL;設三個復孔，于 37℃、5%CO2培養箱中培養4 h，然后將96孔培養板以1500 r/min離心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100 μL，反應3 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30μL，在酶標儀490 nm處測定光密度值(OD)。NK細胞活性(NK cell activity，%)=(ODT－(ODS－ODE))/ODT×100%，ODT:靶細胞空白光密度值，ODS:樣品光密度值，ODE:效應細胞空白光密度值。

2 結果

2.1 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠體內碳粒廓清功能影響

由表1可見，與模型對照組比較，給予3.0 g/kg中國被毛孢、3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉和1.0 g/kg冬蟲夏草后，小鼠碳粒吞噬指數均顯著升高(P＜0.05);而1.0 g/kg中國被毛孢和1.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉有升高小鼠碳粒吞噬指數的趨勢，但無顯著差異(P＞0.05)。

表1 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠體內碳粒廓清功能影響(±s，n=10)Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS and PH in mice(±s，n=10)

表1 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠體內碳粒廓清功能影響(±s，n=10)Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:compared withnormal control group，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜0.01;compared with model control group，*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01

組別/Groups給藥劑量/Drugs吞噬指數/Phagocytic index正常對照組 NS20mL/kg 0.680±0.864模型對照組 NS20mL/kg 3.650±0.257△△HS低劑組 1.0g/kg 3.831±0.318 HS高劑組 3.0 g/kg 3.941±0.213*PH低劑組 1.0 g/kg 3.836±0.405 PH高劑組 3.0 g/kg 3.959±0.229*CS組 1.0g/kg 3.977±0.330*

2.2 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對二硝基氟苯誘導小鼠遲發型變態反應影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組小鼠經二硝基氟苯(DNFB)誘導后，耳廓明顯腫脹和脾臟顯著增大(P＜0.01)，胸腺略有增大，但無顯著性差異(P＞0.05)。給予不同劑量的中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉后均具有不同程度的抑制小鼠耳廓腫脹、脾臟增大，與模型對照組比較，1.5 g/kg中國被毛孢的小鼠耳廓腫脹顯著降低(P＜0.01)，0.5 g/kg中國被毛孢、0.5－1.5 g/kg蝙蝠蛾擬青霉和0.5 g/kg冬蟲夏草對小鼠耳廓腫脹度均明顯降低(P＜0.05);1.5 g/kg中國被毛孢、蝙蝠蛾擬青霉和0.5 g/kg冬蟲夏草能明顯抑制脾臟增大的作用(P＜0.05)，1.5 g/kg中國被毛孢高和0.5 g/kg冬蟲夏草能顯著抑制胸腺增大的作用(P＜0.01，P＜0.05)。

表2 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對DNFB誘導小鼠遲發型變態反應影響(±s，n=10)Tab.2The effects in DNFB－induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice(±s，n=10)

表2 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對DNFB誘導小鼠遲發型變態反應影響(±s，n=10)Tab.2The effects in DNFB－induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:compared with normal control group，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜ 0.01;compared with model control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別/Groups 給藥劑量/Drugs dose 耳腫脹度/Ear swelling(mg)胸腺系數/Thymus index(mg/10 g)正常對照組 NS10mL/kg 0.47±3.50 37.74±7.32 20.65±2.31模型對照組 NS10mL/kg 28.83±8.37△△ 57.52±9.76△△ 22.04±4.25 HS低劑組 0.5g/kg 20.94±3.59* 50.28±6.04 21.05±3.11 HS高劑組 1.5 g/kg 19.30±4.57＊＊ 46.55±4.69* 17.01±2.37＊＊PH低劑組 0.5 g/kg 21.11±5.77* 51.80±8.34 19.23±5.94 PH高劑組 1.5 g/kg 20.03±6.03* 47.23±11.27* 19.30±5.32 CS組 0.5 g/kg 20.78±5.22* 49.41±4.09* 18.03±2.91脾臟系數/Spleen index(mg/10 g)*

2.3 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對SRBC致小鼠溶血素抗體生成影響

由表3可見，與正常對照組比較，模型對照組的小鼠半數溶血值明顯升高(P＜0.01);與模型對照組比較，3.0 g/kg中國被毛孢、1～3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉和1.0 g/kg冬蟲夏草均能顯著升高小鼠的半數溶血值(P＜0.01)，1.0 g/kg中國被毛孢對SRBC免疫小鼠的半數溶血值有明顯升高作用(P＜0.05)。

表3 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對SRBC致小鼠溶血素抗體生成影響(±s，n=10)Tab.3 The effects in SRBC－induced hemolysin antibody by HS and PH in mice(±s，n=10)

表3 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對SRBC致小鼠溶血素抗體生成影響(±s，n=10)Tab.3 The effects in SRBC－induced hemolysin antibody by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.Note:compared with normal control group，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜0.01;compared with model control group，*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01.

組別/Groups 給藥劑量/Drugs dose 半數溶血值/HC50正常對照組 NS20mL·kg－1 53.06±1.44模型對照組 NS20mL·kg－1 309.74 ±38.76△△HS低劑組 1.0 g·kg－1 341.94±29.26*HS 高劑組 3.0 g·kg－1 355.69 ±26.87＊＊PH 低劑組 1.0 g·kg－1 354.84 ±28.66＊＊PH 高劑組 3.0 g·kg－1 363.88 ±14.70＊＊CS 組 1.0 g·kg－1 350.60 ±13.80＊＊

2.4 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠脾淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性影響

由表4可見，與空白對照組比較，中國被毛孢、蝙蝠蛾擬青霉高劑量(3.0 g/kg)組和擬青霉低(1.0 g/kg)劑量、冬蟲夏草組均能顯著提高T淋巴細胞增殖作用(P＜0.01)，中國被毛孢低劑量組也能顯著提高T淋巴細胞增殖作用(P＜0.05)，但作用明顯低于擬青霉低劑組(P＜0.05);中國被毛孢、擬青霉、冬蟲夏草低劑量組還能促進B淋巴細胞增殖作用，而中國被毛孢低劑量組無顯著作用。與正常對照組比較，被毛孢高劑量組(3.0 g/kg)和低劑量(1.0 g/kg)以及冬蟲夏草組均能顯著性提高NK細胞活性(P＜0.05)，被毛孢低劑量(1.0 g/kg)提高NK細胞活性的作用明顯強于蝙蝠蛾擬青霉低劑量(1.0 g/kg)，蝙蝠蛾擬青霉無論高、低劑量組對NK細胞活性均無顯著性差異。

表4 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠脾淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性影響(±s，n=6)Tab.4The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(±s，n=6)

表4 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉對小鼠脾淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性影響(±s，n=6)Tab.4The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(±s，n=6)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 HS低劑組比較，aP＜0.05Note:compared withblank control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with model control group，aP ＜0.05

組別/Groups 給藥劑量/Drugs dose T淋巴細胞SI值/T lymphocytes SI value NK細胞活性/NK cell activity(%)空白對照組 NS20mL/kg 2.355±0.372 1.546±0.309 21.09±4.51 HS低劑組 HS1.0g/kg 2.785±0.404* 1.726±0.184 27.38±4.81*HS高劑組 3.0 g/kg 3.135±0.390＊＊ 1.827±0.136* 27.63±4.88*PH 低劑組 1.0 g/kg1 3.438±0.513＊＊a 1.805±0.135* 21.38±2.44aPH高劑組 3.0 g/kg 3.638±0.824＊＊ 1.906±0.253* 23.54±4.30 CS組 1.0 g/kg 3.311±0.416＊＊ 1.801±0.126* 26.94±5.24 B淋巴細胞SI值/B lymphocytes SI value*

3 討論

中國被毛孢菌粉和蝙蝠蛾擬青酶已有很多文獻報道均有免疫調節功能，其增強或抑制作用取決于機體的生理狀態，即炎癥跡象的程度，在無炎癥跡象時，冬蟲夏草促進DCs向Th1型免疫，反過來，就抑制Th1型超敏反應，在一定程度上體現了中醫藥對機體調控作用的特色［9］。本文通過免疫藥效功能評價體系對中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉一同進行免疫調節作用研究，觀察兩者是否具有差異。

實驗結果顯示，中國被毛孢、蝙蝠蛾擬青霉和冬蟲夏草均具有免疫調節作用，但兩者在作用程強和作用靶向性各有傾向。在免疫增強方面，中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉均可顯著提高小鼠吞噬指數和半數溶血值;同時也均能促進 T、B淋巴細胞增殖能力，但蝙蝠蛾擬青霉作用要強于中國被毛孢;中國被毛孢還能顯著提高NK細胞活性，而蝙蝠蛾擬青霉在本研究中未發現。在免疫抑制方面，中國被毛孢除能抑制小鼠耳廓腫脹程度外，還能抑制小鼠脾臟和胸腺增大，而蝙蝠蛾擬青酶對胸腺增大無作用，中國被毛孢免疫抑制作用要強于蝙蝠蛾擬青霉。

因此，通過檢測中國被毛孢菌粉和蝙蝠蛾擬青霉菌粉對先天性免疫系統NK活性、吞噬指數的影響及對適應性免疫系統細胞免疫、體液免疫的影響，結果表明中國被毛孢、蝙蝠蛾擬青霉均具有免疫調節作用，但中國被毛孢免疫抑制作用及增強天然免疫系統作用要強于蝙蝠蛾擬青霉，而對適應性性免疫系統增強作用蝙蝠蛾擬青霉略強于中國被毛孢。

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［9］Li CY，Chiang CS，TsaimL，et al.Two－sided effect of Cordyceps sinensis on dendritic cells in different physiological stages［J］.Journal of Leukocyte Biology.2009，85(6):987－995.

Comparison and Characterization on Immunomodulatory Function of Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in Mice

FU Hui－ying1，ZHANG Li－zong2，SHOU Qi－yang2，ZHOU Wei－min2，TU Jue2，CHEN Min－li2
(1.The Second Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China;2.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou 310053，China)

Objective Compare with the immunomodulatory function by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in vivo.Method After the mice were administrated by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali.Observed carbon particle clearance function，delayed type hypersensitivity，hemolytic antibody，lymphocyte proliferation and NK cell activity in mice，and Cordyceps sinensis as a positive control.Result 3.0g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali can significantly improve the phagocyte index and half of hemolysis value(P＜0.01).3.0 g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali can significantly improve the T，B lymphocyte proliferation(P＜0.01，P＜0.05).3.0 g/kg Hirsutella sinensis can significantly enhance the activity of NK cells(P＜0.05).0.5～1.5 g/kg Hirsutella sinensis can significantly inhibit the ear edema in mice(P＜0.01，P＜0.05)，at the same time 1.5 g/kg Hirsutella sinensis can inhibit the spleen and thymus increases(P＜0.01，P＜0.05).Conclusion Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali have Immunomodulatory effects.Hirsutella sinensis.The Hirsutella sinensis were better than Paecilomyces hepiali in immunosuppression and enhance the role of the innate immune system.Paecilomyces hepiali were better than the Hirsutellasinensis in enhanced adaptive immune system.

Hirsutella sinensis;Paecilomyces hepiali;Mice;Immunomodulatory function.

R285.5 R332

A

1671－7856(2012)09－0016－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.004

2012－08－25

浙江省自然科學基金項目(Y2110727);浙江省中醫藥科學研究基金計劃(2011ZA021)。

傅惠英(1980－)，女，研究方向:中藥藥理學，E－mail:fhy131@126.com。

壽旗揚(1979－)，男，研究方向:中藥藥理與比較醫學，E－mail:sqy133@126.com。