呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院、國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院、國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

目的 建立呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料及生物制品外源Reo3的檢測(cè)。方法 根據(jù)已發(fā)表的呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)M1基因序列，設(shè)計(jì)合成引物。提取Reo3細(xì)胞毒RNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果 建立的Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法特異、敏感、穩(wěn)定。以Reo3 RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，所能檢測(cè)RNA最小模板濃度為0.42pg/μL，可檢測(cè)病毒最小滴度為10－9/mL。結(jié)論 建立的呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測(cè)方法可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料及生物制品外源Reo3的檢測(cè)。

呼腸孤病毒Ⅲ型;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;人用動(dòng)物源性材料及生物制品

呼腸孤病毒3型(Reo3)為呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬的代表株。病毒粒子無(wú)囊膜，直徑70nm左右。病毒基因組是分節(jié)段雙股RNA(dsRNA)，全基因組分為 L(L1、L2、L3)、M(M1、M2、M3)、S(S1、S2、S3、S4)3 組共 10 個(gè)節(jié)段基因組成，共編碼11種蛋白，其中8種結(jié)構(gòu)蛋白，3種非結(jié)構(gòu)蛋白。此種病毒可感染所有哺乳動(dòng)物，包括豬、牛、小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1－4］。并且能在人、猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細(xì)胞以及Hela、KB、FL和L細(xì)胞等傳代細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病［4－6］。由于上述動(dòng)物和細(xì)胞存在Reo3的自然感染，不僅會(huì)給動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)干擾，而且用上述動(dòng)物源性材料或細(xì)胞生產(chǎn)的人用生物制品也可能存在Reo3的潛在污染，對(duì)人用動(dòng)物源性材料及動(dòng)物源性生物制品的使用安全造成潛在威脅［7］。

因此建立Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法，開(kāi)展對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人用動(dòng)物原材料及動(dòng)物源性生物制品外源Reo3核酸的檢測(cè)。不僅對(duì)保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，而且對(duì)保證人用動(dòng)物源性生物制品原材料及成品的使用安全性至關(guān)重要。本文旨在建立簡(jiǎn)單、快速、特異、敏感的RT-PCR檢測(cè)方法，開(kāi)展對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人用動(dòng)物源性生物材料及其生物制品Reo3的檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

呼腸孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎(PVM)病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)，中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室保存。

1.2 主要試劑

RNA快速提取試劑盒購(gòu)自xygen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Fermentas;dNTP、Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司;PCR儀、核酸瓊脂糖凝膠電泳儀、紫外圖像分析系統(tǒng)等

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

分析已報(bào)道的Reo3基因組序列，將不同株M1基因進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)GenBank中登陸的Reo3毒株基因序列(序列號(hào):M27261.1)選擇保守區(qū)域作為靶基因，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2組引物:1F:5'-ACTGCTGGAATCGTTCGGAG -3'，1R: 5'-GATGAGATGAGGGGTGCGTA-3'; 2F: 5'-GCTGGCGTTGATTCGTT-3'， 2R: 5'-GGGTCGGCTTCTCCTATT-3'。擴(kuò)增片斷大小分別為354 bp和431 bp。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取

對(duì)正常BSC-1細(xì)胞、Reo3感染 BSC-1細(xì)胞毒、小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)，按照RNA快速提取試劑盒(xygen)操作方法進(jìn)行RNA提取。提取后立即進(jìn)行cDNA的合成，剩余的RNA凍存于－70℃冰箱備用。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

通過(guò)對(duì)隨機(jī)引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定反轉(zhuǎn)錄體系為:5×RNA PCR Buffer 5 μL、dNTPs Mixture 4 μL、RNase Free dH2O 6 μL、隨機(jī)引物 0.5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL、病毒 RNA 8 μL，反應(yīng)條件為:42℃孵育 15 min、95℃ 5 min，獲得 cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR檢測(cè)方法的建立

以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)2組引物PCR反應(yīng)體系的 dNTPs濃度、10×Buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量、及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)正常BSC-1細(xì)胞、Reo3感染 BSC-1細(xì)胞毒的進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)確定RT-PCR反應(yīng)的最佳模式。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE(0.04 mol/L Tris乙 酸，0.001 mol/L EDTA，pH8.0)，110 V電泳30 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結(jié)果。RT-PCR陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)與Genbank中Reo3序列進(jìn)行比對(duì)以確定PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.8 特異性的試驗(yàn)

2組引物分別以呼腸孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)和正常BSC-1細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用所建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.9 敏感性的試驗(yàn)

(1)Reo3細(xì)胞毒濃度梯度檢測(cè):

取感染滴度為105.2/mLReo3病毒液，用PBS做系列倍比稀釋?zhuān)衷O(shè) 10－1～10－1010個(gè)稀釋度。取每個(gè)稀釋度病毒液各0.5mL制備模板，用所設(shè)計(jì)的2組引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測(cè)病毒最小滴度。

(2)Reo3 RNA濃度梯度檢測(cè):

將起始濃度為42.4 μg/mL的RNA樣本做倍比稀釋?zhuān)衷O(shè)10－1到10－55個(gè)濃度梯度進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴(kuò)增的最小RNA模板濃度。

1.10 初步應(yīng)用

1.10.1 對(duì)樣品的檢測(cè)

對(duì)2011年送檢的25只SPF地鼠進(jìn)行檢測(cè)。取25只地鼠腎(編號(hào):1～25號(hào))，經(jīng)過(guò)研磨處理后，和正常BSC-1細(xì)胞與Reo3細(xì)胞毒，同時(shí)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用引物1 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.10.2 檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證

擴(kuò)增到的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與 GenBank中 Reo3核酸序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)方法的建立

通過(guò)對(duì)2組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系為:10×ExTaqBuffer(Mg2+Free)2.5μL，dNTPs Mixture(10mmol/L)2.5 μL，Taq HS 酶(5U/μL)0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL，cDNA 2.5 μL，補(bǔ)水至 25 μL;PCR最佳反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 35 個(gè)循環(huán);72℃再延伸5 min。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

2組引物對(duì)Reo3細(xì)胞毒分別擴(kuò)增到長(zhǎng)度約為354 bp和431 bp的特異性目的條帶;BSC-1細(xì)胞陰性對(duì)照均未擴(kuò)增到特異性目的條帶(結(jié)果見(jiàn)圖1)。

從圖1可以看出，雖然2組引物均擴(kuò)增到特異性目的條帶，但引物2擴(kuò)增效果不如引物1。

2.3 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

選擇引物1與引物2的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性片段分別進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST分析，與 GenBank中Reo3核酸序列同源性分別為98%和99%，說(shuō)明該方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較好。

2.4 特異性驗(yàn)證

2組引物在以Reo3為模板進(jìn)行擴(kuò)增有明顯目的條帶出現(xiàn)，小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)和及正常BSC-1細(xì)胞均無(wú)目的條帶(見(jiàn)圖2和圖3)。

圖1 引物1、2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The results of primer 1，2 PCR reaction conditions optimization

圖3 引物2特異性驗(yàn)證Fig.3 Specific validation results of primer 2

圖2、圖3說(shuō)明2組引物PCR檢測(cè)方法特異性均較好。

2.5 敏感性試驗(yàn)

(1)Reo3細(xì)胞毒濃度梯度檢測(cè):第1組引物在病毒液稀釋至10－9/mL時(shí)，仍可見(jiàn)目的條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖4);第二組引物僅能檢測(cè)到病毒液原液濃度。

圖4 引物1RT-PCR檢測(cè)敏感性測(cè)定——Reo3細(xì)胞毒濃度梯度Fig.4 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 1—Cytotoxic concentration gradient of Reo3

由圖4和圖5可知第1組引物較第2組引物敏感性強(qiáng)。

(2)Reo3 RNA濃度梯度檢測(cè):第1組引物在Reo3 RNA模板稀釋至10－5時(shí)仍可見(jiàn)目的條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖5)，即所能檢測(cè)到的最小RNA模板濃度至少能達(dá)到0.42 pg/μL;第2組引物在 Reo3 RNA模板原濃度時(shí)，僅隱約可見(jiàn)目的條帶出現(xiàn)。

由上述結(jié)果可看出，所建立的RT-PCR方法，在保證了特異性的前提下，靈敏度較高，所能檢出的Reo3最小病毒滴度可達(dá)10－9/mL，檢出的最小Reo3 RNA濃度為0.42 pg/μL。綜上比較可得，第1組引物PCR方法的特異性、靈敏度較第2組引物強(qiáng)，適合作為Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法。

圖5 引物1RT-PCR檢測(cè)敏感性測(cè)定——Reo3 RNA模板濃度梯度Fig.5 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 1—RNA template concentration gradient of Reo3

2.6 初步應(yīng)用

2.6.1 利用第1組引物對(duì)25只地鼠腎進(jìn)行檢測(cè):Reo3毒種擴(kuò)增到長(zhǎng)度約354 bp的特異性目的條帶，正常BSC-1細(xì)胞和1～25號(hào)地鼠腎均無(wú)目的條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖6、圖7)。

圖6 利用引物1檢測(cè)1～16號(hào)地鼠腎電泳結(jié)果Fig.6 The electrophoretic results of detection in 1to16 ground mouse kidneys using primers 1

3 討論

Reo3作為人畜共患傳染病在禽類(lèi)及有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大動(dòng)物中，在國(guó)內(nèi)外檢測(cè)的較多，建立的檢測(cè)方法也較多，包括血清學(xué)及分子生物學(xué)發(fā)方法［1，3，8，9］。但針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料和人用動(dòng)物源性生物制品的檢測(cè)，目前在我國(guó)還是空白。本實(shí)驗(yàn)所建立的Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法，其目的主要是用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料和人用動(dòng)物源性生物制品潛在Reo3的檢測(cè)。尤其是一些人用生物制品生產(chǎn)用原材料來(lái)源于動(dòng)物的組織、細(xì)胞等，如流行性乙型腦炎(JE)疫苗、麻疹疫苗等。

圖7 利用引物1檢測(cè)17～25號(hào)地鼠腎電泳結(jié)果Fig.7 The electrophoretic results of detected in 17 to 25 ground mouse kidneys using primers 1

本實(shí)驗(yàn)所建立的Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，2組引物特異性均較好;通過(guò)敏感性實(shí)驗(yàn)比較，可以看出引物1較引物2敏感性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。引物1檢測(cè)最小病毒滴度可達(dá)到Reo3細(xì)胞毒原液10－9，與本實(shí)驗(yàn)室建立的免疫熒光檢測(cè)方法檢測(cè)滴度104.7/mL相比，敏感性要高的多;檢測(cè)RNA濃度可達(dá)0.42 pg/μL;引物2病毒含量檢測(cè)只能達(dá)到Reo3細(xì)胞毒原液濃度，檢測(cè)RNA最小濃度為42.4 μg/mL。因此用引物 1建立的 Reo3 RTPCR檢測(cè)方法較用引物2建立的Reo3 RT-PCR檢測(cè)方法更適合應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料和人用動(dòng)物源性生物制品的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)之所以選擇25只地鼠腎用于Reo3的檢測(cè)，是因?yàn)槟壳拔覈?guó)乙腦疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞來(lái)源是SPF原代地鼠腎細(xì)胞或傳代地鼠腎細(xì)胞。而地鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用也很廣泛。25只地鼠腎Reo3病毒檢測(cè)均為陰性，與本室 ELISA方法Reo3抗體檢測(cè)均為陰性結(jié)果相吻合，更保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和地鼠使用的安全性。

本實(shí)驗(yàn)所建立的RT-PCR檢測(cè)方法特異、敏感、可靠，穩(wěn)定性好，檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人用動(dòng)物源性材料和人用動(dòng)物源性生物制品Reo3及其核酸的攜帶或殘留的檢測(cè)。為保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量及人用動(dòng)物源性材料和人用動(dòng)物源性生物制品的使用安全性提供了可靠依據(jù)。

［1］常繼濤，李鑫，張亞科，等.犢牛腹瀉糞樣中牛呼腸孤病毒的分離鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(9):711－715.

［2］冷雪梅，胡建華，高誠(chéng)，等.呼腸孤病毒3型S1基因的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)［J］.2008，38(07):582－586.

［3］侯麗波，佟魏，謝軍芳，等.小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型標(biāo)準(zhǔn)化血清制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志［J］.2010，20(8):60－64.

［4］趙亞力，孫衍慶，周捷，等.外源3型呼腸孤病毒污染原代地鼠腎細(xì)胞的光鏡及電鏡診斷［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2001，14(1):33－35.

［5］Michael R，Roner and Bradley G，Steele.Features of the mammalian orthoreovirus 3 Dearingl1 single-stranded RNA that direct packaging and serotype restriction［J］.Journal of General Virology(2007)，88，3401－3412.

［6］Tyler KL，Barton ES，Ibach ML，Etc.Isolation and molecular characterization of a novel type 3 reovirus from a child with meningitis［J］.J Infect Dis.2004 May 1;189(9):1664－1675.

［7］王軍志，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛，等.2002.10生物技術(shù)藥物研究開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:325－334.

［8］Wright MH，Cera LM，Sarich NA，Etc.Reverse transcriptionpolymerase chain reaction detection and nucleic acid sequence confirmation ofreovirus infection in laboratory mice with discordantserologic indirectimmunofluorescence assay and enzyme-linked immunosorbent assay results［J］.Comp Med.2004 Aug;54(4):410－417.

［9］Su YP，Su BS，Shien JH，Etc.The sequence and phylogenetic analysis of avian reovirus genome segments M1，M2，and M3 encoding the minor core protein muA，the major outer capsid protein muB，and the nonstructural protein muNS［J］.J Virol Methods.2006 May;133(2):146－57.Epub 2005 Dec 6.

［10］Michael R，Roner G，Bradley G，Etc.Features of the Mammalian Orthoreovirus 3 Dearing l1 single-stranded RNA thatdirect packaging and serotype restriction［J］.Joumal of General virology(2007)，2008:3401－3412

［11］Uchiyama A，Besselsen DG.Detection of Reovirus type 3 by use of fluorogenic nuclease reverse transcriptase polymerase chain reaction［J］.Lab Anim.2003 Oct;37(4):352－359.

Development of A RT-PCR Method for Determination of Mammalian Orthoreovirus 3

WANG Ji，WEI Li，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei
(National Institutes for food and drug Control，National Center for quality of Laboratory Animal，Beijing 100050，China)

Objective To develop a RT-PCR method for determination of Mammalian Orthoreovirus 3(Reo3)in laboratory animal and the biological materials or the biological products for human use from the animal.Methods Two pair of primers specific to the sequences of M1 gene were designed according to the published Mammalian Orthoreovirus 3.With which the RNA of Reo3 was extracted and reversely transcribed to cDNA as a template for PCR amplification.The developed RT-PCR method was optimized，verified for specificity and sensitivity.Results The developed RT-PCR method is good in ensitivity，specificity and stability，and its minimum detection limit using the recombinant plasmid containing Reo3 gene as atemplate was 0.42pg/μL，and the lowest detection virus titer is 10－9/mL.Conclusion The developed RT-PCR method can be used in detecting the Mammalian Orthoreovirus 3(Reo3)in laboratory animaland the biological materials or the biological products for human use from the animal.

Mammalian Orthoreovirus 3;RT-PCR;Laboratory animal;Biological materials and the biological products for human use

Q781;R33

A

1671-7856(2012)09-0046-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.010

2012-08-24

“國(guó)家科技支撐計(jì)劃”疫苗類(lèi)生物制品安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究(2008BAI54B01)。

王吉(1974－)，女，副研究員，研究方向:微生物學(xué)和免疫學(xué)。

賀爭(zhēng)鳴(1957－)，男，研究員，博士，研究方向:微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail:zhengminghe57@163.com。