杏鮑菇菌絲體多糖提取條件的優化研究*

郭金龍 邢麗萍 王玉芬 孫國琴

(1.內蒙古清谷新禾有機食品集團有限責任公司,呼和浩特 010051;2.內蒙古大學,呼和浩特 010021;3.內蒙古農牧業科學院,呼和浩特 010030)

杏鮑菇 (Pleurotus eryngii(DC.)Qué l.),別名刺芹側耳,隸屬于擔子菌綱,傘菌目,側耳科,側耳屬[1]。杏鮑菇菌肉肥厚,質地脆嫩,具有杏仁香味和類似鮑魚的口感,適合保鮮、加工,深得人們的喜愛,享有 “平菇王”的美譽。杏鮑菇寡糖含量豐富,與雙歧桿菌共用,有改善腸胃功能和美容的效果[2],入藥有降血壓、降血脂、降低膽固醇和增強肌體免疫力之功效[3]。多糖是杏鮑菇中具有生物活性的主要有效組分之一,國內研究2003年才見報道[4]。近幾年的研究結果表明,杏鮑菇所含的真菌多糖具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤、抗病毒、抗過敏、抗衰老、降低膽固醇和增強機體免疫的功效[5～7]。杏鮑菇子實體和液體發酵菌絲體都可作為多糖提取的原料。俞苓等[4]用熱水浸提結合酶法試驗結果表明,果膠酶和中性蛋白酶均可大大提高多糖得率,可分別達368 mg/g粗多糖和176 mg/g粗多糖。侯軍等[8]響應面優化法能夠提高杏鮑菇菌糠的多糖提取率,最大提取率達6.43%。

由于子實體生產周期長,勞動強度大,易受氣候影響,產品的產量及質量不穩定,且子實體木質化程度高,因此人工栽培子實體的多糖提取利用率較低。而采用生物發酵技術生產杏鮑菇菌絲體,周期短、成本低、產量大,具有工業化生產前景[9]。相關研究表明,發酵法獲得的菌絲體和人工栽培的子實體,不管是多糖含量,還是多糖的藥理效果,兩者都比較接近,在有些情況下菌絲體多糖的含量和藥理效果比子實體還要好[10]。因此本試驗選擇杏鮑菇菌絲體作為原料,探討多糖提取方法,利用正交試驗對熱水浸提法提取杏鮑菇多糖的最佳工藝進行了優化,為深入研究杏鮑菇菌絲體多糖奠定基礎,也為杏鮑菇保健食品的開發利用提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器 試驗材料:通過液體發酵得到的杏鮑菇菌絲體,無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸 (以上均為分析純),碘-碘化鉀溶液。所用儀器:貝克曼離心機64R(3萬轉)、JY92-2D超聲波細胞粉碎機、電熱鼓風干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴槽、ZK-2BS型真空干燥箱、BW320S電子天平。

1.2 試驗方法

(1)菌絲體發酵培養。將斜面試管菌種接種于液體搖瓶中,25℃、150 r/min條件下培養7天制成液體母種,然后將母種以2%接種量接入液體搖瓶培養基中,培養10天左右得到菌絲體原料。

多糖提取工藝流程:菌絲體→洗滌→破碎→熱水浸提→離心 (25℃)→上清液真空濃縮→醇析→離心 (4℃)→乙醇洗滌→真空干燥→粗多糖成品。

(2)醇析多糖條件研究。①乙醇加入量的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,分別加入95%的乙醇10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL,密封,在低溫 (4℃)下放置過夜,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測定多糖含量,并計算多糖得率。②醇析時間的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,加入上述試驗確定的乙醇量,密封,在低溫下分別放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測定多糖含量,并計算多糖得率。

(3)菌絲體細胞壁破碎方法的研究。菌絲體在熱水浸提前需要進行細胞破碎,目的是提高多糖的溶出率和縮短浸提時間,試驗比較了以下3種方法對杏鮑菇多糖提取率的影響。

①烘干粉碎法:屬于傳統方法,將菌絲體在60℃電熱鼓風干燥箱中烘干,用研缽粉碎,過60目篩。

②超聲破碎法:采用JY92-2D型超聲波細胞粉碎機,變輻桿Φ 6,功率600 W。

③低溫凍融法:將菌絲體冷凍 (約-15℃),然后室溫融化,反復多次。

(4)杏鮑菇菌絲體多糖的浸提條件研究。①浸提溫度選擇試驗:確定料液比 (菌絲體濕重g/蒸餾水體積mL)為1∶8,浸提時間1 h不變的條件下,比較不同浸提溫度對多糖得率的影響,以選擇最佳浸提溫度。②浸提時間選擇試驗:在料液比1∶8,及由上述試驗確定的浸提溫度不變的條件下,比較不同浸提時間對多糖得率的影響,根據其多糖得率確定最佳浸提時間。③浸提料液比試驗:在上述試驗確定的最佳溫度、最佳時間不變的條件下,選擇不同的料液比提取多糖,根據多糖得率確定最佳料液比。

(5)正交試驗。根據單因子試驗確定的條件范圍,通過L9(34)正交試驗,得出最佳浸提條件。

(6)多糖含量的測定。稱取粗多糖樣品0.01 g左右,加入100 mL蒸餾水中沸水浴30 min溶解多糖并定容至250 mL,得杏鮑菇多糖溶液。采用苯酚-硫酸比色法[11]測定吸光度,并計算多糖含量。

多糖得率 (%)=多糖含量/菌絲體干重×100%。

2 結果與分析

2.1 乙醇加入量對多糖得率的影響 醇析試驗中乙醇加入量對杏鮑菇多糖得率的影響見圖1。從圖1可知,乙醇加入量1～3倍時多糖得率漸次明顯增加,說明乙醇加入量小于3倍時,多糖沉淀不完全;而乙醇加入量大于3倍后,多糖得率趨于平緩,說明3倍的乙醇加入量已基本能把多糖完全沉淀下來,再增加乙醇用量意義不大。從經濟角度考慮,選擇3倍為醇析時的乙醇加入量。

2.2 醇析時間對多糖得率的影響 醇析試驗中醇析時間對杏鮑菇多糖得率的影響見圖2。從圖2可以看出,醇析時間小于4 h多糖得率增加明顯,說明多糖沉淀不完全;醇析6 h以上曲線變得平緩;8 h后多糖得率無明顯增加,說明此時多糖已沉淀完全。因此醇析時間選擇8 h是恰當的。

2.3 低溫凍融法對多糖得率的影響 采用低溫反復凍融的方法處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統的烘干粉碎法作對照,結果表明,隨著低溫凍融次數的增加,杏鮑菇多糖得率略有增加,但增加量很小,即使反復凍融5次,多糖得率仍然在1%左右,遠遠低于傳統烘干粉碎法 (圖3)。可見低溫凍融法破碎作用較弱,只適用于細胞壁較脆弱的微生物菌體,而不適用于細胞壁較厚的杏鮑菇菌絲體。

圖1 乙醇加入量對多糖得率的影響

圖2 醇析時間對多糖得率的影響

2.4 超聲波法對多糖得率的影響 采用超聲波以不同方式處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統的烘干粉碎法作為對照,結果是,只進行 10 min超聲破壁而不進行熱水浸提,多糖得率比傳統的烘干粉碎法低,僅為超聲處理5 min并進行熱水浸提的50.32%。說明超聲處理不能完全取代熱水浸提的作用。超聲處理10 min多糖得率達到最高,為 4.73%,再繼續延長超聲處理時間,多糖得率反而有下降的趨勢,這可能是因超聲波處理時間過長,導致多糖結構發生變化,糖鏈斷裂,多糖得率下降 (圖4)。因此,應選擇超聲處理10 min并進行熱水浸提為最佳的處理條件。

2.5 不同浸提溫度對多糖得率的影響 分別在60℃、70℃、80℃、90℃、沸水 (97℃)時提取杏鮑菇多糖,測定多糖得率,結果為:浸提溫度對多糖得率有很大影響,80℃以下多糖的浸提得率隨著溫度的升高而明顯增加;80～97℃多糖浸提得率增加趨于平緩;在溫度為97℃的沸騰狀態,多糖得率最高 (圖5)。因此,97℃宜作為杏鮑菇菌絲體多糖的浸提溫度。

2.6 不同浸提時間對多糖得率的影響 分別選取浸提時間1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h提取杏鮑菇多糖,測定多糖得率,結果如圖6所示:提取時間在1～2 h之間,多糖得率是逐漸增大的;繼續延長加熱時間,多糖得率反而漸趨減少。因此,浸提時間選擇2 h是比較合理的。

2.7 不同料液比對多糖得率的影響 按照1∶6、1∶8 、 1∶10、 1∶12、1∶14、 1∶16、1∶18、1∶20 的料液比,分別提取杏鮑菇菌絲體多糖,測定多糖得率的結果 (圖7),料液比由1∶6到 1∶10時,多糖得率直線上升,繼續增大加水量多糖得率變化不大。因此,選用1∶10料液比較為合理。

圖3 凍融處理對多糖得率的影響

圖4 超聲波處理對多糖得率的影響

圖5 浸提溫度對多糖得率的影響

圖6 浸提時間對多糖得率的影響

2.8 正交試驗結果與分析 根據以上單因子試驗結果,3個因子中最優條件分別為:浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶10。因此,在正交試驗時各因子的水平依表1選取;試驗計算結果如表2所示。

從表2可以看出,對多糖得率的影響,3個因子中,A因子 (浸提溫度)的極差最大,B因子 (浸提時間)次之,C因子 (料水比)最小。熱水浸提法提取杏鮑菇菌絲體多糖的最佳工藝組合為A3B3C1,即浸提溫度97℃,浸提時間3 h,料液比1∶8。但由于浸提時間2 h和3 h的k值僅相差0.04,而在生產上則要付出更多的能耗。為了達到最佳的經濟效益,生產上應該選組合A3B2C1,即浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶8的工藝組合。

運用SPSS(13.0)統計分析軟件[12]對表2結果進行方差分析,結果見表3。從表3可以看出,浸提溫度的顯著值(Sig.)為0.033(0.01＜P＜0.05),有顯著性影響;浸提時間和料液比的顯著值 (Sig.)分別為0.198和0.600(P＞0.05),無顯著影響。說明在所選擇的水平范圍內,浸提溫度的改變對多糖得率有顯著的影響,其他2個因子對多糖得率的影響不顯著。影響因子重要性順序為A＞B＞C。

3 結論和討論

3.1 結論

(1)菌絲體細胞破碎方法選擇超聲波法。低溫凍融法不適合杏鮑菇菌絲體細胞破碎。超聲波法與烘干粉碎法相比,前者不必將菌絲體烘干,既簡化了提取工藝,又提高了多糖得率。

(2)醇析時優化工藝條件為:3倍體積95%乙醇沉淀8 h以上。

(3)浸提溫度97℃、浸提時間2 h、料液比1∶8為最佳浸提工藝條件。在此條件下,菌絲體多糖的提取率可達6.52%,較未優化前提高近1倍。

3.2 討論

(1)杏鮑菇多糖。自從真菌多糖抑制腫瘤的活性被發現以后,真菌多糖越來越受人們的關注,成為生物化學、免疫學、醫藥學和食品科學等學科的一個非常活躍的研究領域。盛偉等[3]對來源于白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇3種不同菌類的多糖進行體外抗氧化活性研究,發現杏鮑菇對超氧陰離子自由基的清除能力最強,杏鮑菇子實體干品中多糖含量高達9.9%,它與胃腸中的雙岐桿菌共同作用,具有很好的促進消化、吸收功能,是理想的美容、保健食品。挖掘食用菌潛力,提高其產品附加值,是食用菌工作者的責任和義務,我們正在采用離子束誘變技術試圖提高菌絲體中的多糖含量,同時必須探索先進的提取技術將其從菌絲體中提取出來。這正是本文研究的要旨。

(2)菌絲體的前處理。多糖的提取方法常用的有熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶法等。稀酸、稀堿條件下,易使部分多糖發生水解,從而破壞多糖的活性結構,使多糖的得率減少。用酶法提取雖然條件溫和,但是成本太高。因此,我們采用熱水浸提法,并通過超聲破碎法和低溫凍融法處理菌絲體細胞來彌補傳統熱水浸提法需要多次浸提,多糖得率低的缺點。

圖7 料液比對多糖得率的影響

表1 正交試驗因子水平表

表2 正交試驗結果

(3)利用正交設計優化提取工藝。正交設計的基本特點是用部分試驗來代替全面試驗,通過對部分試驗結果的分析,了解全面試驗的情況。如本試驗對浸提溫度、浸提時間、料液比3因子,每個因子3水平試驗,若不考慮交互作用,可利用正交表L9(34)安排,試驗方案僅包含9個水平組合,就能反映試驗方案包含27個水平組合的全面試驗的情況,找出最佳的生產條件,再參考單因子試驗確定各因素的水平,利用正交試驗得出浸提時的最佳浸提工藝條件,并通過工業生產經濟核算,最終確定生產中的最佳浸提工藝條件,為食用菌的精深加工提供科學技術依據。

表3 試驗結果的方差分析

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