非黑色素性皮膚癌組織中血管內皮生長因子及其受體1和受體2的表達

趙 綺，劉林嶓#，李廣帥，張 晨

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院整形外科 鄭州 450052

2)鄭州大學第四附屬醫(yī)院口腔預防科 鄭州 450052

皮膚鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)與皮膚基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)又被稱為非黑色素性皮膚癌，二者均起源于表皮或其附屬器角質形成細胞[1]，其病因復雜，發(fā)病機制尚不十分清楚。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為內皮細胞特異絲裂原直接參與腫瘤的血管生成，VEGF受體1(Flt-1)與VEGF受體2(KDR)是VEGF的糖基化跨膜受體，直接參與VEGF胞內信號轉導。VEGF及其受體Flt-1、KDR與腫瘤血管生成關系密切，不僅在血管內皮細胞表達，也表達于腫瘤細胞[2-4]。作者采用免疫組化染色方法檢測了皮膚SCC和BCC組織中VEGF、Flt-1和KDR蛋白的表達，探討非黑色素性皮膚癌的發(fā)病機制，以期為非黑色素性皮膚癌的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科2007年3月至2009年3月確診為皮膚SCC和BCC的組織蠟塊。其中SCC 26例，患者中男16例，女10例，年齡37～77歲;BCC 18例，患者中男8例，女10例，年齡40～65歲。選擇同期皮瓣移植切除的正常皮膚組織標本10例(男、女各5例)作對照。所有病例均有完整的病歷資料，無系統(tǒng)性疾病、皮膚疾病、結締組織病及重要臟器疾病史，術前無放療、化療等治療史。

1.2 VEGF、Flt-1和 KDR蛋白的檢測 標本均3～4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，采用免疫組化SP法檢測VEGF、Flt-1和KDR蛋白。SP9000試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物工程技術服務有限公司。高溫熱修復組織抗原，阻斷內源性過氧化氫酶，用正常血清(按10倍稀釋)封閉組織內非特異抗原;滴加一抗(均為兔抗人多克隆抗體，美國 Santa Cruz，按100倍稀釋)，溫育1 h后取出，4℃過夜，PBS沖洗;滴加二抗，PBS沖洗;滴加三抗，PBS沖洗;DAB染色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 VEGF、Flt-1、KDR蛋白陽性細胞均表現為胞質中棕黃色顆粒狀著色。在Olympus雙目顯微鏡高倍鏡下觀察并采集信號，使用Biosens Digital Imaging System v1.6圖像分析軟件分析圖像信號，用積分光密度(IOD)值表示染色的強弱[5]。每個樣本取5個視野的IOD，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0進行分析，3組VEGF、Flt-1和KDR蛋白IOD的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Pearson相關分析分析SCC組織中3種蛋白表達的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

VEGF、Flt-1、KDR蛋白主要表達于腫瘤實質細胞、表皮基底層以上除角質層外的細胞以及部分血管內皮細胞。皮膚SCC、BCC及正常組織中3種蛋白的表達見圖1和表1。皮膚SCC組織中VEGF、Flt-1和KDR蛋白的表達高于皮膚BCC和正常組織，皮膚 BCC組織中3種蛋白的表達高于正常組織。

皮膚 SCC組織中 VEGF與 Flt-1(r=0.773，P ＜0.001)、VEGF 與 KDR(r=0.676，P ＜0.001)、Flt-1 與 KDR(r=0.718，P ＜0.001)的表達均呈正相關。

圖1 3種組織中VEGF(A)、Flt-1(B)及KDR(C)蛋白的表達(SP，×400)

表1 皮膚正常、SCC及BCC組織中VEGF、Flt-1、KDR蛋白的表達

3 討論

通常認為，腫瘤血管的生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要步驟之一。腫瘤血管新生是一個復雜的過程，受多種因子(促進血管新生的正調節(jié)因子及抑制血管新生的負調節(jié)因子)的調控[6]。VEGF是重要的促血管生成因子[7]，多數惡性腫瘤細胞具有自分泌VEGF的功能。VEGF是目前發(fā)現的最為強大和專一的刺激內皮細胞增生的因子，除此外，它還有增加血管通透性、趨化血管內皮細胞等功能。VEGF及其受體Flt-1、KDR與腫瘤血管生成關系密切，不僅在血管內皮細胞表達，而且也表達于腫瘤細胞[2-4]。研究[8]表明Flt-1與KDR的功能是有差異的，Flt-1與VEGF的親和力較高，KDR與VEGF的親和力較弱。Flt-1是最早發(fā)現的VEGF受體，對其生物學功能的認識尚有爭論，目前認為其主要作用為KDR的降解受體，起負向調節(jié)VEGF的作用，而在某些病理條件下又能發(fā)揮正向調節(jié)VEGF的作用;而大多數功能性內皮細胞的VEGF信號轉導通過激活KDR來實現，包括刺激內皮細胞增殖，增加血管通透性及對內皮細胞的趨化作用等[9]。該研究中，VEGF、Flt-1、KDR在皮膚BCC和SCC組織中的表達明顯高于正常皮膚組織，而且在血管內皮細胞與腫瘤細胞均有表達，提示VEGF及其受體Flt-1、KDR一方面作用于血管內皮細胞，促進血管通透性增加及血管內皮細胞增殖，誘導腫瘤血管新生，另一方面可以直接作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞分裂增殖。3者在皮膚SCC中的表達顯著高于在皮膚BCC中的表達，提示3種蛋白的表達可能與腫瘤的病理特點有關，BCC具有生長緩慢、很少轉移的生物學特性。3種蛋白在SCC中的表達呈正相關，提示VEGF及其受體Flt-1、KDR在腫瘤組織中存在協同作用，從而促進腫瘤血管新生和腫瘤細胞增殖。因此可以通過干擾VEGF及其受體信號轉導途徑的各個環(huán)節(jié)抑制腫瘤的生長;VEGF及其受體有望成為皮膚腫瘤治療的一個新靶點。

[1]Stratton SP.Prevention of non-melanoma skin cancer[J].Curr Oncol Rep，2001，3(4):295

[2]Lacal PM，Ruffini F，Pagani E，et al.An autocrine loop directed by the vascular endothelial growth factor promotes invasiveness of human melanoma cells[J].Int J Oncol，2005，27(6):1625

[3]Vieira JM，Santos SC，Espadinha C，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors in thyroid carcinomas of follicular origin:a potential autocrine loop[J].Eur J Pathol，2005，153(5):701

[4]Wey JS，Fan F，Gray MJ，et al.Vascular endothelial growth factor receptor 1 promotes migration and invasion in pancreatic carcinoma cell lines[J].Cancer，2005，104(2):427

[5]李濤，范妤，劉芳.免疫組織化學圖像光密度分析的標準化方法[J].解剖學雜志，2008，31(5):727

[6]Stinga AC，Margaritescu O，Stinga AS，et al.VEGFR1 and VEGFR2 immunohistochemical expression in oral squamous cell carcinoma:a morphometric study[J].Rom J Morphol Embryol，2011，52(4):1269

[7]Bondo H.Vascular endothelial growth factor and bevacitumab in breast cancer[J].Breast Cancer，2007，14(2):163

[8]馬驪，王小寧，張智清，等.人血管內皮生長因子受體配體結合域[J].生物化學與生物物理學報，2000，32(5):463

[9]Roskoski R Jr.Vascular endothelial growth factor(VEGF)signaling in tumor progression[J].Crit Rev Oncol Hematol，2007，62(3):179