哮喘小鼠肺和下丘腦組織中γ-氨基丁酸受體ARα的表達

朱亞蕊，劉劍波

鄭州大學第二附屬醫院呼吸內科 鄭州 450014

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳動物重要的抑制性神經遞質之一，在中樞神經系統分布廣泛，也存在于氣道平滑肌細胞及氣道上皮細胞等周圍組織[1]。根據受體對激動劑和拮抗劑的敏感性，GABA受體可以分成 GABAAR、GABABR和GABACR 3種。GABAAR屬受體門控離子受體超家族，α亞單位在GABAAR復合物的組裝和功能中可能起主要作用[2]。GABAAR和GABA合成酶(GAD65/67)在支氣管上皮細胞中均有表達，組成了完善的GABA系統。已有研究[3-4]表明，過敏性哮喘時GABA系統功能增強，霧化吸入GABAAR拮抗劑可抑制哮喘氣道黏液分泌，抑制氣道重塑。氣道杯狀細胞增生是哮喘的主要病理特征，MUC5AC是在氣道杯狀細胞表達的一種主要黏蛋白，反映了氣道黏液分泌情況[5]。作者對哮喘小鼠肺組織和下丘腦內GABAARα、肺組織中MUC5AC進行了檢測，旨在從分子水平探討哮喘小鼠肺和腦組織中GABAARα的變化及其與氣道黏液分泌的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 6周齡清潔級雌性BALB/C小鼠30只，購于河南省實驗動物中心，體質量(20±2)g，按隨機數字表法分為3組，對照組、哮喘組、地塞米松組，每組10只。實驗第1天和第8天，哮喘組和地塞米松組小鼠腹腔注射卵蛋白(OVA)/Al(OH)3混合液 1 mL(含 OVA 1 mg和 Al(OH)3100 mg，OVA購于Sigma公司)致敏，從實驗第15天開始以用10 g/L OVA霧化吸入30 min/d激發，連續7 d。對照組致敏與激發均以生理鹽水代替，地塞米松組在激發前腹腔注射地塞米松1 mg/kg。

1.2 標本的采集和處理 末次激發后24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將生理鹽水注入右心室沖洗2次以洗盡肺和腦內血液。暴露胸腔，切取左肺葉近肺門組織，多聚甲醛固定5～6 h后，轉入體積分數70%乙醇，常規石蠟包埋切片備用。切取右肺葉迅速放入液氮中，速凍后轉移至－80℃保存備用。打開顱腔，迅速取出全腦組織置于冰臺上，分離出下丘腦，一側放入甲醛，一側速凍后放入－80℃冰箱保存備用。

1.3 肺組織病理學觀察 取肺組織切片，常規HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞浸潤情況。

1.4 肺組織糖原(PAS)染色觀察 將肺組織切片放入高碘酸水溶液氧化5 min，蒸餾水浸洗后在Schiff液中浸泡10～20 min，蒸餾水洗后用無水乙醇脫水，中性樹脂封片，觀察。

1.5 肺組織和下丘腦組織中GABAARα mRNA、肺組織中MUC5AC mRNA的檢測 根據GenBank中GABAARα、MUC5AC和GAPDH的基因序列設計引物。MUC5AC引物序列:上游 5’-CAGCCGAG GAGGGTTTGATCT-3’，下 游 5’-AGTCTCTCTC CGCTCCTCTCAAT-3’，擴增產物大小 349bp。GABAARα 引物序列:上游 5’-TGGGAAGAA CAAATCTGTGG-3’，下 游 5’ -GTAGCCTTGGGT GAAGCAAT-3’，擴增產物大小636 bp。GAPDH引物序列:上游 5’-TCTTGGGCTACACTGAGGAC-3’，下游 5’-CATACCAGGAAATGAGCTTGA-3’，擴增產物大小126 bp。取約100 mg組織標本加液氮研磨后加入1 μL Trizol試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，參照說明提取總RNA，取4 μL逆轉錄合成cDNA。以2 μL cDNA為模板，行PCR擴增。擴增條件:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，53℃(GABAARα和GAPDH)或52℃(MUC5AC)退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環;72℃總延伸6 min。取5 μL擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶顯色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析。以目的基因和β-actin擴增條帶的灰度值之比表示目的基因mRNA的相對表達量。

1.6 肺和下丘腦組織中GABAARα蛋白的檢測采用免疫組化SP法。小鼠抗GABAARα單克隆抗體(按50倍稀釋)購自北京博奧森生物技術有限公司，SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術服務有限公司。切片常規脫蠟水化，微波抗原修復，用體積分數3%H2O2除去內源性氧化酶，余步驟按試劑盒說明書進行。GABAARα蛋白染色陽性信號為棕黃色顆粒。用彩色圖像分析系統測定5個200倍視野的光密度，取其平均值，表示目的蛋白表達強度。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析。3組肺和下丘腦組織中GABAARα蛋白和mRNA的表達量、肺組織中MUC5AC mRNA表達量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，哮喘組肺與下丘腦組織中GABAARα mRNA表達、GABAARα蛋白表達及肺組織中GABAARα與MUC5AC mRNA表達的關系分析采用Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組小鼠肺組織病理學表現 對照組小鼠氣道黏膜正常，氣道周圍無炎性細胞浸潤，肺泡壁結構完整;哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，黏膜層增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎癥細胞浸潤;地塞米松組黏膜水腫及炎癥細胞浸潤較哮喘組減輕。見圖1。

圖1 3組小鼠肺組織病理學表現(HE，×200)

2.2 3組小鼠氣道PAS染色情況 對照組可見氣管及各級支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞形態完整，在纖毛間極少見杯狀細胞，肺泡大小正常。哮喘組、地塞米松組支氣管、亞段支氣管、細支氣管管壁可見大量染成紫紅色的杯狀細胞;支氣管黏膜上皮局部剝脫，黏膜下明顯水腫;黏膜層、黏膜下層及肌層有嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞浸潤;支氣管管腔內分泌物增加，部分可見淋巴細胞。地塞米松組上述表現較哮喘組明顯減輕。見圖2。

2.3 3 組小鼠肺組織中 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表達 見圖3和圖4。肺組織中GABAARα蛋白主要表達于氣道上皮，在基底部無表達，陽性表達產物定位于細胞膜。哮喘組小鼠肺組織 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白表達量較對照組增高，地塞米松組 較哮喘組明顯降低，但仍高于對照組(表1)。

表1 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表達

2.4 3組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達 見圖3和圖5。GABAARα蛋白在下丘腦組織中主要表達于神經元胞質、胞膜和凸起，胞核無染色。哮喘組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達較對照組明顯增高。地塞米松組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達較哮喘組降低，但與對照組比較，兩者的表達水平仍較高(表2)。

圖5 3組小鼠下丘腦GABAARα蛋白的表達(SP，×200)

表2 3組小鼠下丘腦GABAARα mRNA和蛋白的表達

2.5 哮喘組小鼠各指標之間相關性分析 哮喘組小鼠肺組織GABAARα與MUC5AC mRNA的相對表達量呈正相關(r為 0.814，P=0.004)。哮喘組小鼠下丘腦與肺組織中GABAARα mRNA的相對表達量、蛋白表達水平均呈正相關(r分別為0.740、0.791，P 分別為 0.014、0.006)。

3 討論

過敏性哮喘是有多種細胞和細胞成分參與的氣道慢性炎癥，發病機制不完全清楚。中樞神經系統在哮喘發作中發揮重要作用，有學者[6]提出了哮喘發病的中樞致敏機制及中樞免疫調節機制。下丘腦是邊緣系統的重要核團，是免疫和應激反應的重要整合中樞[7]，可直接或間接參與氣道張力和過敏反應的調控[8]。作者觀察到，哮喘小鼠下丘腦GABAARα蛋白表達增強，這就增加了GABA與其受體結合的機會，增強了GABA的抑制作用，表明GABA可能是參與哮喘病理生理過程的重要中樞性神經遞質之一，進一步證實中樞神經系統在哮喘病理生理過程中發揮作用。哮喘小鼠腦組織中GABA受體增加的機制可能是:由于血清中增高的IL-13、IgE、IL-5等炎癥因子通過血腦屏障到達中樞系統，或通過哮喘激發時由于缺氧或緊張導致神經興奮上傳到中樞，使中樞神經系統炎癥因子增多，導致GABA受體增加。哮喘發作時機體處于一種應激狀態，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)興奮，大腦興奮性神經遞質大量釋放，為平衡興奮性神經遞質，抑制性神經遞質GABA釋放亦增多，GABA受體表達上調是一種中樞神經保護機制。

氣道黏液過度分泌是重癥哮喘的特征之一。研究[9]表明 GABA系統和黏液分泌關系密切，阻斷GABAAR后能夠抑制哮喘急性發作期的黏液分泌和杯狀細胞增生。該研究結果表明，過敏性哮喘小鼠被OVA激發后氣道上皮細胞GABAAR mRNA表達增多，氣道杯狀細胞增生，MUC5AC mRNA表達亦增強，兩者具有相關性。研究[10]證實，GABAAR的運輸及細胞表面靶作用由PI3K調節，其可被不同的信號活化，包括胰島素、生長因子及白介素。哮喘患者T細胞可產生大量白介素如IL-4、IL-13、IL-5、IL-10等，這些白介素可能通過活化上皮細胞的PI3K/Akt通路激發神經元細胞后突觸區GABAAR[11]，通過 GABA 引起氣道黏液的大量分泌。

作者還觀察到，地塞米松組小鼠肺和腦組織中GABAARα、肺組織中MUC5AC的表達均較哮喘組低，說明地塞米松治療哮喘的機制包括抑制炎癥因子釋放，下調肺組織和腦組織GABA受體的表達，減輕黏蛋白的分泌。哮喘小鼠下丘腦與肺組織中GABAARα的表達均呈正相關，提示GABA系統可能與哮喘的中樞神經調節有關，但肺和腦組織中GABA的具體信號傳導機制及腦內其他神經遞質的變化還有待進一步研究。

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