燈盞細辛對大鼠腎冷缺血再灌注損傷的保護作用

楊鐵軍，何朝宏#，曹新廣，任君凱，陳小兵，王 躍

1)河南省腫瘤醫院;鄭州大學附屬腫瘤醫院泌尿外科 鄭州 450008

2)鄭州大學第一附屬醫院器官移植中心 鄭州 450052

腎移植手術過程中，冷灌注、冷保存及復流熱灌注等損傷因子對移植腎造成的冷缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury，IRI)無法避免，是影響移植腎功能恢復的重要因素。目前臨床已應用一些防治IRI的藥物，但是效果均不十分理想，且昂貴。燈盞細辛又名燈盞花，屬菊科短亭飛蓬屬植物。已有文獻[1-2]證實其對腦、心等臟器的IRI具有保護作用。作者模擬臨床腎移植術中移植腎經歷的IRI過程，建立大鼠冷IRI模型，觀察燈盞細辛對冷IRI導致的腎臟組織超微結構、功能和生化指標的影響，為尋找防治冷IRI的有效藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 燈盞細辛注射液(云南生物谷燈盞花藥業有限公司)，HC-A離體腎灌注液(上海長征醫院)冰凍備用，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性與丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)，日本日立公司日立H-7500透射電鏡，顯微手術器械(上海醫療器械廠)，10倍手術顯微鏡(鎮江光學儀器廠)，自制大鼠手術臺、腎臟冷保存袋等。

1.2 實驗動物來源、分組及處理方法 雄性成年SD大鼠36只，體質量250～300 g(河南省實驗動物中心提供)。術前24 h禁食，不禁水。實驗前采用隨機數字表將大鼠分為假手術組、模型對照組(給予冷IRI處理)和實驗組(給予冷IRI+燈盞細辛處理)3組(n=12)。3組均在術前經鼠尾靜脈采血標本。實驗組術前15 min經尾靜脈注射燈盞細辛注射液1.2 mL/100 g，假手術組與模型對照組按相應劑量注射生理鹽水。假手術組處理方法:應用20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，正中切口打開腹腔，切除右腎并游離左腎蒂，60 min后關閉腹腔切口。模型對照組和實驗組建立冷缺血再灌注模型[3]:①首次冷灌注。切除右腎，10倍顯微鏡下在右腎動脈殘端插管，經過腹主動脈至左腎動脈內，原位灌注左腎HC-A離體腎灌注液8～10 mL(0～4℃)，左腎立即變蒼白，觸之冰涼，為灌注成功。通過右腎靜脈殘端插管直接將灌注液引流出體外，約2 min完成冷灌注后，用無損傷血管夾阻斷左腎蒂，結扎右腎蒂。②冷缺血保存:充分游離左腎，將其牽至腹腔外，向左側傾斜手術臺，在自制的保存袋中用冰水混合物浸泡左腎，實施冷保存。簡單縫合腹壁切口，盡量減少腹腔暴露對機體的影響。③再灌注:60 min后再次打開腹腔，去除腎臟冷保存袋，開放左腎動靜脈血管夾使左腎復灌，肉眼可見腎臟由蒼白色變為鮮紅色，表明再灌注成功。左腎復位，縫合切口。3組大鼠均在術后6 h開始給予100 g/L葡萄糖水喂養，自然光照，24 h后再次麻醉，原切口打開腹腔，下腔靜脈采血標本，立即摘取左腎。

1.3 觀察指標 采用透射電鏡觀察左腎超微結構的變化;制作腎臟組織勻漿，檢測腎組織勻漿中SOD活性、MDA含量;手術前后取血標本，檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性、MDA含量的差異，應用重復測量數據的方差分析比較3組大鼠手術前后血漿BUN、Cr水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠左腎電鏡觀察結果 假手術組:近曲小管上皮細胞結構完整，微絨毛位置正常，排列整齊;細胞核結構清晰，染色質分布均勻;線粒體形態正常，呈長圓形或卵圓形，無腫脹，嵴清晰，基質均勻豐富(圖1A)。模型對照組:近曲小管上皮細胞排列尚規律，較多微絨毛脫落至管腔中;胞質內可見大量空泡變性;線粒體腫脹明顯，形態失常，嵴結構紊亂，部分線粒體膜破裂;細胞核結構改變，可見染色質邊集，電子密度增高，部分細胞核消失(圖1B)。實驗組:近曲小管上皮細胞排列規整，多數微絨毛在正常位置，有少部分微絨毛脫落至管腔中;線粒體輕度腫脹，其膜完整，部分嵴結構紊亂;胞質內可見少量空泡樣變性，細胞器局部排列疏松，多數細胞核內染色質尚均勻(圖1C)。

圖1 3組大鼠左腎近曲小管上皮細胞的電鏡結果(×5000)

2.2 3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性與MDA水平比較 見表1。

表1 3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性與MDA水平比較

2.3 3組大鼠手術前、后血漿BUN、Cr水平比較見表2。

表2 3組大鼠手術前、后血漿BUN、Cr水平比較(n=12)

3 討論

腎移植是治療終末期腎病的有效治療方法，隨著精確的基因配型與強效免疫抑制藥物的應用，排斥反應對移植物的威脅不斷減少。而缺血再灌注在腎移植過程中不可避免。文獻[4]報道IRI觸發受體固有免疫，與移植物長期生存有關[5]，因此器官移植領域愈加重視IRI對移植物存活的影響，一直在致力尋找防治IRI的有效藥物。燈盞細辛主要分布在我國云南地區，文獻[6]報道燈盞細辛中含有豐富的咖啡酸乙酯等黃酮類物質，具體成分尚未完全查明，具有抗血栓、抑制凝血、促進纖溶活性及改善血液的高凝狀態和微循環等作用。

作者應用大鼠腎冷缺血再灌注觀察燈盞細辛對腎臟IRI的保護作用。腎組織勻漿生化結果顯示:實驗組中SOD活性高于模型對照組，MDA含量低于模型對照組，差異均具有統計學意義。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA是脂質過氧化物，測試MDA的含量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映細胞損傷的程度。腎臟缺血再灌注前應用燈盞細辛可以明顯提高SOD的活性，提高機體清除氧自由基的能力，且MDA含量降低，提示氧化損傷減輕。血生化結果顯示:實驗組缺血再灌注后24 h的BUN、Cr低于模型對照組，差異均具有統計學意義，證實應用燈盞細辛后冷缺血再灌注對腎臟功能的損害減輕。透射電鏡觀察發現，假手術組腎臟正常，模型對照組腎臟組織中的線粒體等細胞器形態失常，胞質內空泡樣改變。實驗組較模型對照組損傷明顯減輕，2組在腎曲小管的差異最大(該部位是產生氧自由基最多的地方)。氧化損傷是IRI中最重要的途徑，在超微結構中線粒體的損傷最明顯，該研究中線粒體形態學變化符合IRI過程中該細胞器的功能變化。

有研究報道三七總苷[7]、苦菜總黃酮[8]對腎、心等器官IRI的保護作用也是通過其抗氧化作用實現的。該研究結果表明燈盞細辛能夠減輕大鼠腎臟冷IRI中的氧化損傷，證實該藥物對靶器官腎臟亦具有保護作用。作者將進一步研究該藥物對IRI過程中腎小管上皮細胞的信號傳導與細胞凋亡等分子生物學機制的影響。

[1]楊淑艷，鐘秀宏，鄭中華，等.燈盞花素對腦缺血再灌注損傷的細胞和分子保護機制研究現狀[J].中國藥房，2009，20(9):714

[2]王利果，李樹青.燈盞細辛對大鼠心肌缺血再灌注心律失常和細胞凋亡的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(1):52

[3]楊鐵軍，謝小娟，陳小兵，等.大鼠腎冷缺血再灌注損傷模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2011，28(6):998

[4]McKay DB.The role of innate immunity in donor organ procurement[J].Semin Immunopathol，2011，33(2):169

[5]Timsit MO，Yuan X，Floerchinger B，et al.Consequences of transplant quality on chronic allograft nephropathy[J].Kidney Int Suppl，2010，119:S54

[6]谷黨英.燈盞細辛的研究進展及臨床應用[J].河北中醫藥學報，2009，24(2):48

[7]張可，李華，王軍.三七總苷對大鼠缺血再灌注腎損傷的保護作用[J].鄭州大學學報:醫學版，2006，41(6):1165

[8]劉仰斌，李啟華，劉欣.苦菜總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].鄭州大學學報:醫學版，2010，45(1):107