單次低劑量丙泊酚聯合肢體缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

劉月強，趙素貞，孟凡民，崔明珠

河南省人民醫院麻醉科 鄭州 450003

腦缺血是人類第三大死因和致殘的首位原因，而近10%的接受人造瓣膜植入術、頸動脈內膜剝脫術等手術的患者處于腦缺血危險中[1]。動物實驗[2]證實，麻醉劑可誘導神經保護作用，有助于降低手術期間腦缺血的發病率及病死率。丙泊酚是一種新型靜脈麻醉劑，具有起效快、蘇醒迅速而完全、持續輸注后無蓄積等特點，廣泛應用于手術麻醉[3]。研究[4]表明，丙泊酚可減輕腦缺血再灌注損傷。但Fudickar等[5]發現丙泊酚持續輸注時間超過48 h和(或)劑量大于4 mg/(kg·h)時，患者可能突發心動過緩合并代謝性酸中毒、高脂血癥、肝脂肪浸潤、橫紋肌溶解、肌紅蛋白尿，出現繼發性急性腎衰竭，甚至發展為難治性心力衰竭，即丙泊酚輸注綜合征。同時，麻醉劑量的丙泊酚可致老年大鼠短期性認知功能障礙，反復注射丙泊酚可引起新生大鼠遠期認知功能減退[6-7]。作者觀察了單次低劑量丙泊酚與肢體缺血后處理聯合應用對大鼠腦缺血再灌注的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 100只健康雄性成年SD大鼠，體質量240～260 g，由鄭州大學實驗動物中心供應。MDA、SOD、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，AR-2140型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TGL 16M離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，多功能酶標儀(Sigma公司)。丙泊酚(AstraZeneca公司，意大利)。

1.2 實驗方法 100只大鼠隨機分成假手術組、模型組、丙泊酚組、肢體缺血后處理組和聯合治療組，每組20只，10只進行神經功能檢測和腦梗死面積測定，另10只進行生化指標檢測。腦缺血再灌注模型的制備:模型組大鼠采用40 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，于頸部正中切開皮膚，分離并夾閉左側頸總動脈，結扎頸外動脈，于頸總動脈分叉下方約1.0 mm處開一小口，將直徑為2.6 mm的魚線插入頸內動脈直至遇到阻力，插入深度為19～20 mm;縫合動物頸部皮膚并維持體溫;2 h后抽出魚線，恢復血液供應[8]。假手術組大鼠僅分離組織與血管，不留置魚線。丙泊酚組大鼠于缺血前10 min腹腔注射4 mg/kg丙泊酚;肢體缺血后處理組在缺血1.5 h后，用彈性止血帶于雙后肢中、上1/3部位結扎大鼠雙后肢，以后肢遠端表面皮膚溫度降低，顏色呈絳紫色為判斷后肢缺血是否成功的標準，每次結扎5 min，再灌注5 min，重復3次;聯合治療組大鼠既給予4 mg/kg丙泊酚，又進行肢體缺血后處理。

1.3 觀測指標

1.3.1 神經功能檢測 參照Longa等[9]的方法，在恢復血供22 h后進行神經功能缺陷評分。0分:無神經功能缺陷癥狀;1分:右側前肢屈曲;2分:向右側旋轉;3分:向對側傾倒;4分:不能行走或昏迷。

1.3.2 腦梗死面積 動物處死后，迅速取出腦組織，去除嗅球、小腦、低位腦干，置于切片槽中，間隔2 mm行連續冠狀切片;將腦片放入10 g/L的紅四氮唑溶液中，于37℃恒溫避光溫育30 min。取出，用40 g/L的多聚甲醛固定1 h后，拍照，采用圖像分析儀測定腦梗死面積。

1.3.3 腦組織 MDA、SOD、GSH-Px 活性及 TNF-α和IL-6水平 另取缺血側腦組織，置于冰生理鹽水中清洗后，用濾紙吸干表面水分，放入組織勻漿器中制備10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液。用比色法測定腦組織中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性、蛋白質含量，用ELISA法檢測腦組織中TNF-α和IL-6水平(以每g蛋白里上述指標的含量表示)，按照試劑盒說明進行操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0處理數據。應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較5組間以上指標的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組大鼠神經功能缺陷評分和腦梗死面積的比較見表1，假手術組上述兩指標均為0。各組大鼠MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的比較見表2。各組大鼠TNF-α和IL-6水平的比較見表3。

表1 各組大鼠神經功能缺陷評分和腦梗死面積的比較(n=10)

表2 各組大鼠MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的比較(n=10)

表3 各組大鼠TNF-α和IL-6水平的比較(n=10) ng/g

3 討論

作者采用經典的線栓法制備了腦缺血再灌注損傷模型，探討單次腹腔注射低劑量丙泊酚聯合肢體缺血后處理能否協同抗腦缺血再灌注損傷。有研究者[10-11]選擇于缺血前10 min腹腔注射丙泊酚，而腦缺血后使用丙泊酚有可能增強缺血后炎癥反應，所以作者在缺血前10 min腹腔注射4 mg/kg丙泊酚。

該研究結果顯示，單次低劑量丙泊酚或肢體缺血后處理可部分改善所觀察指標如降低腦缺血再灌注大鼠神經功能缺陷評分，減小腦梗死面積，降低腦組織中氧化產物MDA含量，增強抗氧化物酶SOD、GSH-Px活性，同時降低炎癥因子TNF-α和IL-6水平，而二者聯用，以上指標均有明顯改善。二者聯用可能通過抑制氧化應激和炎癥反應減輕腦缺血再灌注損傷。原因可歸結于以下方面:丙泊酚可干擾脂質過氧化奪氫過程，酚基與脂質過氧化反應形成一個更穩定的無活性產物，阻斷脂質過氧化鏈式反應;又可從轉錄水平抑制各種炎癥因子的表達及炎性級聯反應，減輕組織炎性損傷[12-13]。肢體缺血后處理則能誘導內源性-κ-阿片激動劑釋放，激活線粒體ATP敏感性鉀通道，減輕線粒體內鈣超載，抑制線粒體滲透性轉換孔發生滲透性轉換，產生神經保護作用;還能促進腦缺血區熱休克蛋白70表達，抑制腦缺血再灌注小鼠腦皮層神經元凋亡[14-15]。

總之，單次低劑量丙泊酚和肢體缺血后處理聯用可改善腦缺血再灌注大鼠神經功能缺陷，減小腦梗死面積，同時避免大劑量和(或)多次丙泊酚注射所引起的不良反應。

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