褪黑素對脊髓損傷早期大鼠神經生長因子表達的影響

徐玉生，馬玉斐，李星晨，曾冠楠

鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

脊髓原發機械損傷后會引起一系列級聯式的病理變化，主要包括局部微循環障礙、氧化應激[1]、中性粒細胞浸潤[2]、細胞壞死和凋亡[3]等，而脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)往往又是全身多發創傷的一部分，患者病情常常復雜而嚴重。目前治療SCI療效確切的藥物并不多，其中最常用的是甲基強的松龍(methylprednisolone，MP)，但應用 NASCIS 24 h給藥方案可引起繼發于MP的急性內固醇性肌病[4]，大劑量MP還可能引發肺部及胃腸道并發癥，易導致高齡者呼吸系統并發癥及感染[5]。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體產生的一種作用廣泛且功能強大的吲哚類激素，具備抗腫瘤、調節生物體晝夜節律、抗氧化及清除自由基、鎮痛及免疫調節[6-7]等作用，對SCI有較強的治療作用，但對其機制的研究大多局限于抗氧化及清除自由基方面。作者通過觀察MT對SCI大鼠血清神經生長因子(nerve growth factor，NGF)水平、脊髓組織內NGF mRNA和蛋白表達水平的影響，探討MT治療SCI的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物:SPF級健康成年雄性SD大鼠60只，體質量(350±30)g，購自河南省實驗動物中心，許可證號:SCXK(豫)2010-0002。②主要試劑及儀器:Trizol試劑、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、EasyTaq DNA Polymerase試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司;大鼠NGF檢測試劑盒購自美國RD公司;兔抗鼠NGF抗體、DAB試劑盒、SP9002免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;MDA測定試劑盒、總SOD測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司;MT購自美國Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司);D-140圖像記錄分析系統(大連Jim-X Scientific公司)。

1.2 動物模型的建立 大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術臺上。術區備皮，常規消毒，取后正中切口，以T12為中心顯露T11～T13棘突和椎板，咬除該節段椎板，暴露脊髓硬膜。先于硬膜上方放置一塊矩形的塑料墊片(0.4 mm×0.3 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用5 g的重錘自距硬膜10 cm的高處沿導管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的標準:打擊后鼠尾出現無規則的痙攣性擺動、雙下肢呈回縮性撲動，硬膜表面充血水腫。術畢以生理鹽水沖洗術野，再次消毒后常規縫合。

1.3 實驗分組 按隨機數字表法將大鼠分為3組，每組20只。模型組和MT組按上述方法造模后10 min分別腹腔注射等體積的無水乙醇及MT(100 mg/kg)，假手術組僅行椎板切除術不損傷脊髓。3組大鼠均給予青霉素40萬U肌內注射，并于術后4、8 h人工輔助排尿2次。觀察并記錄3組大鼠的一般情況。

1.4 觀測指標

1.4.1 Basso Beattie Bresnahan(BBB)運動功能評分術后12 h將大鼠置于實驗臺上，待其適應環境后由2位熟悉評分標準但不知分組者獨立觀察10 min，進行BBB運動功能評分，取平均值作為評分結果。

1.4.2 脊髓組織中NGF mRNA的檢測 BBB運動功能評定完成后，每組大鼠均取12只，斷頭取血，并以損傷處為中心取約1 cm長的脊髓，生理鹽水沖洗干凈后－80℃條件下保存。取凍存的脊髓標本100 mg，研碎后以Trizol法提取總 RNA，逆轉錄得 cDNA，取2 μL按試劑盒說明書配制反應體系，以GAPDH為內參，進行PCR擴增。NGF引物序列:正義鏈為 5’-AATCAACTCCTGCTTGGC-3’，反義鏈為5’-GTATTTAGCCCCTCCTCC-3’，擴增長度 349 bp。GAPDH引物序列:正義鏈為 5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，反義鏈為 5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’，擴增長度595 bp。PCR反應條件:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環;72℃總延伸6 min。取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，以NGF與GAPDH條帶灰度值的比值表示NGF mRNA的相對表達量。

1.4.3 血清NGF水平檢測 血液室溫靜置30 min自然凝固，3000 r/min離心20 min后收集血清，－20℃條件下保存。采用ELISA法檢測NGF，按試劑盒說明操作，最終于450 nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線，計算NGF水平。

1.4.4 脊髓標本病理觀察和NGF蛋白檢測 另8只大鼠剖胸后經左心室-主動脈插管，多聚甲醛灌流固定，以損傷處為中心取出約1 cm長的脊髓，常規制片，5 μm厚連續切片，HE染色，觀察脊髓病理改變。每只大鼠取同序數切片3張，按SP9002試劑盒說明書操作進行NGF蛋白檢測，以PBS代替一抗作為陰性對照。胞核和(或)胞質黃褐色或黑色著色為陽性細胞。每張片計數高表達區3個高倍視野中的陽性細胞數，取算術平均數代表該標本NGF蛋白的表達水平。

1.5 統計學處理 實驗數據采用SPSS 17.0進行分析，3組BBB評分、血清NGF水平、脊髓組織中NGF mRNA及蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，方差齊時，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane’s T2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠術后一般情況觀察 模型組大鼠術后精神萎靡，進食量較術前明顯減少，飲水增多。MT組和假手術組大鼠術后精神狀況明顯好于模型組，進食量較術前無明顯變化，但飲水均增多。模型組和MT組大鼠術后均出現不同程度的尿潴留情況，均需人工輔助排尿;均出現明顯的后肢運動功能障礙，表現為雙側后肢無法支撐身體，尾巴持續下垂或翹起無力，活動時前后肢動作不協調，總是由前肢拖動身體移動等。假手術組基本無運動功能障礙。3組BBB評分結果見表1。由表1可知，與假手術組比較，模型組和MT組的BBB評分明顯降低，但模型組與MT組比較差異無統計學意義。

2.2 3組大鼠脊髓標本病理表現 模型組和MT組均可見脊髓組織內片狀出血、結構紊亂及神經細胞水腫等變化，但MT組上述病理變化較模型組輕;假手術組脊髓結構清晰，無出血、神經細胞水腫等，見圖1。

2.3 3組大鼠血清NGF水平及脊髓組織中NGF mRNA和蛋白檢測結果 見圖2、3和表1。NGF蛋白陽性細胞主要集中于脊髓前角和其周圍的灰質中，多聚集成團。由表1可知，與假手術組比較，模型組和MT組血清NGF水平、脊髓組織NGF蛋白和mRNA表達水平均明顯升高，MT組較模型組升高更明顯。

圖2 3組大鼠脊髓組織中NGF mRNA的表達

圖3 3組大鼠脊髓前角組織中NGF蛋白的表達(SP，×400)

表1 3組BBB評分、血清NGF水平及脊髓組織NGF mRNA和蛋白的表達

3 討論

雖然大量的研究已經證實MT對于SCI具有較強的治療作用，但大多是圍繞其抗氧化、抑制炎癥反應、減少神經細胞凋亡[3，6-8]等機制去解釋的，而該研究則主要關注其對SCI大鼠體內NGF表達水平是否有影響。NGF是1951年發現的首個典型的神經營養因子，它對多種神經細胞的發育、存活和功能的維持具有重要作用。SCI后大鼠體內NGF的表達會保護性升高，這種生理反應有利于支持受損神經細胞的存活和修復[9]。但 SCI后局部微環境中NGF水平不能維持持續有效是預后不佳的重要原因之一[10-11]。NGF屬于多肽蛋白質，難以透過血腦屏障，且其生物半衰期短，需長期反復給藥才能維持有效的濃度，使得其臨床應用受到了很大限制[12]。

作者觀察到SCI模型組和MT組大鼠體內NGF水平較假手術組升高，而MT組大鼠體內NGF水平較模型組升高更明顯，且其脊髓的病理變化較模型組減輕，提示MT可以通過提高體內NGF的表達，促進SCI的修復。MT憑借其高度脂溶性的分子結構，可輕易地穿過血腦屏障并于數分鐘內在神經組織中濃集[13]，同時具有較高的安全性，在生理和治療劑量下均無明顯的副作用[14]，使得MT治療SCI更具優勢。實驗中MT雖可顯著改善損傷后脊髓的病理變化，但并未改善損傷后早期(12 h內)大鼠的運動功能障礙，可能是由于該治療劑量的MT還不具備此效力，或是此時還處于脊髓休克早期，其治療作用還未完全表現出來。作者將進一步觀察應用MT后更長時間段內大鼠體內NGF水平的變化規律及神經功能恢復情況，對MT治療SCI的機制進行深入探討。

作者還觀察到MT組大鼠術后在精神狀態和食欲方面明顯好于模型組。MT可維持生物正常的晝夜節律，減少由SCI引起的節律紊亂而造成的疲勞、焦慮和抑郁[15];同時MT有明顯的鎮痛作用[16]。這些作用也有利于損傷的恢復。

總之，作者認為，MT可通過抗氧化、調節NGF的表達及改善節律紊亂等，在SCI治療方面發揮有效作用，這為臨床應用MT治療SCI提供了理論依據。

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