抗抗總黃曲霉毒素單抗F(ab’)2多克隆抗體的制備及特性

劉智勇，孫錦峰

1)鶴壁市衛生監督中心 鶴壁 458030

2)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFB)是由寄生曲霉和產毒的黃曲霉污染糧油及其制品、飼料所產生的有毒次生代謝產物。黃曲霉毒素 B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最強，污染最為嚴重，是自然界存在的最嚴重的化學致癌物之一。許多國家和地區都規定了食品及飼料中AFB1的最大允許含量，并作為強制性標準進行檢測和控制。我國對AFB1的污染和控制也非常重視。目前常應用抗AFB1單克隆抗體(單抗)的免疫分析方法測定AFB1，但因在檢測過程中必須頻繁接觸較高濃度的AFB1標準品，導致很多檢測人員具有很強的心理戒備。另外，由于發達國家對毒素標準品的禁運，我國很難得到AFB1標準品，使得食品及飼料中AFB1的檢測分析受到限制。利用Jerne的免疫網絡學說[1-3]可知抗獨特型抗體(Ab2)在空間構象上與抗原存在內影像關系，能替代原始抗原，因此利用抗黃曲霉毒素單抗的F(ab’)2片段可制備出抗抗黃曲霉毒素單抗獨特型抗體，后者有望作為AFB1標準品的替代品用于AFB1的無毒免疫學檢測。作者采用多克隆抗體(多抗)的制備方法生產出抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型抗體，并對其特性進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 SephacrylTMS-200分子篩凝膠和甘氨酸(美國Amersham公司)，無花果蛋白酶、AFB1、牛血清白蛋白、血藍蛋白(KLH)、辣根過氧化物酶(HRP)、戊二醛和正辛酸(美國Sigma公司)，硫酸銨(北京化學試劑公司)，HRP標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(北京欣經科生物技術公司)，96孔可拆分酶標板(美國Gibco公司)。抗總黃曲霉毒素單抗、抗赭曲酶毒素(OA)單抗、抗T-2毒素單抗、抗河豚毒素(TTX)單抗均由作者制備。低溫高速離心機(德國HermLe公司)、SUNRISE酶標分析儀(瑞士Tecan公司)、AKTA快速蛋白液相色譜系統(美國Amersharm公司)。

1.2 實驗動物 健康雄性日本大耳白兔3只，健康雌性日本大耳白兔1只，體質量1.0～1.5 kg，購自北京富豪動物養殖中心[SCXK(京)2000-0019];6～8周齡雌性未經產BALB/C小鼠3只，購自軍事醫學科學院。

1.3 抗總黃曲霉毒素單抗2G2株F(ab’)2片段的制備 用無花果蛋白酶酶切辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化[4]所得的抗總黃曲霉毒素單抗2G2株腹水(均由鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室制備)，采用分子篩凝膠過濾法經快速蛋白純化儀(FPLC)分離純化酶切片段，得到單抗F(ab’)2片段，經特性鑒定后－20℃凍干保存。

1.4 大分子免疫原F(ab’)2-KLH的制備 采用戊二醛一步法。將1 mL F(ab’)2片段與含20 mg純KLH的凍干粉末溶解于適量硼酸緩沖液(pH 10.0)中，然后緩慢加入新鮮配制的1 mL體積分數0.3%戊二醛溶液，室溫避光放置2 h，期間輕輕攪拌，加入1 mol/L甘氨酸終止未反應的戊二醛，靜置30 min。加20倍體積的硼酸緩沖液(pH 8.5)透析過夜，每4 h換液1次。

1.5 免疫血清的制備和純化 取F(ab’)2-KLH及F(ab’)2片段(均為1 g/L)，各加等體積的CFA充分乳化后，分別于家兔背部皮下多點注射免疫。首次免疫后間隔3周，再以1 mL免疫原(0.5 g/L)加等體積IFA乳化后，注入皮下多點加強免疫。而后，每隔2周按第二次免疫法重復加強免疫。每次免疫前抽少許靜脈血，分離血清，采用抗體包被酶標板檢測抗體滴度，待抗體滴度達到平臺期后，以250 μg免疫原耳緣靜脈免疫，3 d后頸動脈放血處死。血液于4℃環境下放置，約1 h，使血塊凝固收縮，收集析出的血清，剩余血塊全部傾入離心管，在常溫下2500 r/min離心30 min，取上清液與前面的血清混合，分裝成1 mL/管，－20℃保存。

1.6 單抗-HRP復合物的制備 采用過碘酸鈉法。分別將HRP與抗總黃曲霉毒素單抗、抗赭曲酶毒素單抗、抗T-2毒素單抗和抗河豚毒素單抗連接。在1.2 mL純水中溶解5 mg HRP，加入新配制的0.1 mol/L 過碘酸鈉(pH 7.0)0.3 mL，置室溫 20 min。在1 mmol/L醋酸鈉(pH 4.0)中4℃透析24 h，期間更換透析液數次。用0.02 mol/L碳酸鈉溶液(pH 9.5)制備抗體樣品至10 g/L。將0.5 mL抗體加至經透析的HRP溶液中，置室溫2 h。加入100 μL硼氫化物(4 g/L)，置4℃ 2 h。在PBS內透析，于－20℃保存備用。

1.7 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗的性質測定

1.7.1 一般特性檢測 以包被量為0.625 g/L的AFB1-BSA作為包被抗原，采用間接競爭ELISA法檢測2種免疫原制備所得的兔血清的靈敏度(采用抑制率質量濃度表示，即達到20%、50%和80%競爭抑制時兔血清的質量濃度)，選用靈敏度較好的一種兔血清，采用辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化。以羊抗兔 IgG為包被抗原，用間接非競爭ELISA法檢測兔IgG含量。分別以AFB1-BSA、T-2-BSA、OA-BSA、TTX-BSA為包被抗原，以合適質量濃度的相應單抗-HRP復合物作為反應抗體，以梯度質量濃度的兔多抗血清作為競爭抗原，采用直接競爭法檢測交叉反應，鑒定抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗的特異性。

1.7.2 與 AFB1鏡像關系檢測 ①替代游離AFB1:以包被量為0.625 mg/L的 AFB1-BSA作為包被抗原，以合適質量濃度的2G2單抗作為反應抗體，不同稀釋度的兔多抗血清和AFB1作為競爭抗原，在相同體系下采用間接競爭ELISA法檢測各自競爭2G2單抗上AFB1結合位點的能力。②替代AFB1包被抗原:分別以經辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化的兔多抗血清(包被量為2.3 mg/L)和AFB1-BSA(包被量為0.625 mg/L)作為包被抗原，不同稀釋度的兔多抗血清和游離AFB1作為競爭抗原，與等體積合適質量濃度的2G2-HRP 4℃混合過夜后，次日100 μL/孔加入酶標板，采用直接競爭ELISA法檢測競爭抑制情況。

1.7.3 Ab2β亞型的鑒定 采用小鼠生物學法。將兔血清用8.5 g/L生理鹽水稀釋成1 g/L，首次用200 μL(即200 μg)兔血清加等體積的CFA充分乳化后免疫BALB/C小鼠，右側腹腔注射，2周后用0.5 g/L的兔血清 200 μL(即 100 μg)加等體積的IFA充分乳化后加強免疫，而后，每隔2周按第二次免疫法重復加強免疫。免疫3次后取小鼠內眥靜脈血，以0.625 g/L的 AFB1-BSA為包被抗原，檢測抗體滴度。

2 結果

2.1 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗的一般特性 F(ab’)2及F(ab’)2-KLH免疫所得的多抗的蛋白含量分別為40和70 g/L，20%、50%和80%競爭抑制時的質量濃度分別為 1.00、4.00、25.00、7.00、43.75 和 233.33 mg/L。該多抗與抗 T-2 單抗、抗OA單抗和抗TTX單抗交叉反應均＜0.1%。

2.2 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗與AFB1的鏡像關系 制備的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗純化后，替代游離AFB1達到20%、50%和80%競爭抑制時的質量濃度分別為1、4和25 mg/L，分別相當于0.47、2.74 和16.00 μg/L 游離 AFB1;該抗體替代AFB1包被抗原達到20%、50%和80%競爭抑制時的質量濃度分別為1、4和19 mg/L，分別相當于0.33、1.35 和5.45 μg/L 游離 AFB1。

2.3 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗亞型的鑒定 生物學鑒定小鼠血清稀釋度曲線見圖1。由圖1可見，在多抗質量濃度達到2 g/L時OD(460 nm)值明顯增高，可知所得多抗為Ab2β亞型。

圖1 Ab2β亞型鑒定曲線

3 討論

獨特型抗體是指具有獨特型抗原決定簇的抗體，而Ab2是指針對獨特型抗體的獨特型抗原決定簇產生的抗體。根據 Ab2的特點和功能可分為Ab2α、Ab2β、Ab2γ 及 Ab2δ 4 種不同類型，只有Ab2β型是由位于異種抗體(Ab1)的抗原結合位點的獨特型決定簇產生的抗體，根據抗原抗體在空間構象上互補的特點，即獨特型抗原決定基和抗原的結合部位相同，Ab2β中存在所謂的抗原內影像，可替代抗原用于免疫學分析[5-6]。

Ab2的制備方法有傳統的免疫學方法即多抗或單抗的制備以及基因工程方法[7]。常規方法是用完整抗體充當免疫原進行制備，但完整IgG具有以下局限:抗體的Fc段因能與正常細胞膜上的Fc受體結合而降低了單抗的特異性;大分子抗體的穿透力不強，反應時空間位阻大;在異種免疫制備Ab2時，具有種屬特異性的抗體Fc段免疫原性較強，產生的多是針對Fc的抗體，而針對具有抗原特異性的Fab的抗體較少。因此，制備去除抗體Fc段而保留有抗原結合能力的F(ab’)2或Fab片段，具有重要的意義。以Ab1免疫動物獲得血清多抗時，產物中除了Ab2外還含有抗同種型和抗同種異型決定簇的抗體，而且由于同種型決定簇的免疫原性比獨持型要強，因而產生的Ab2也主要為抗同種型抗體和抗同種異型抗體[8-10]。為了最大程度地得到Ab2，作者采用了基本剔除了抗同種型和抗同種異型決定簇的Ab1 F(ab’)2片段作為免疫原制備Ab2，得到了靈敏度和特異性較好的Ab2多抗[11]。但在研究中發現，采用戊二醛一步法連接大分子蛋白KLH的F(ab’)2片段免疫所得的Ab2雖然具有較高的抗體滴度，但是靈敏度較差，原因可能在于采用戊二醛一步法連接時KLH掩蓋了Ab1 F(ab’)2的抗原決定簇部位，雖然大分子免疫原能產生很高滴度的抗體，但抗獨特型抗體所占的比例很少，大部分是針對KLH和F(ab’)2恒定區的抗體。因此，如要提高抗體免疫原性還需探索。

作者采用經典的間接競爭ELISA法檢測制備的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗，發現可替代線性范圍為0.03 ～10.00 μg/L 的游離 AFB1。而當將該抗體作為包被抗原時，開始采用間接競爭ELISA法檢測，發現陰性空白值始終偏高，檢測系統可信度不高，原因可能為包被抗原是多抗，酶標的羊抗兔二抗也是多抗，交叉反應較為嚴重。作者將單抗聯結HRP，采用直接競爭一步法進行檢測，以避免交叉反應的發生，以抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗作為包被抗原，可替代線性范圍為 0.02 ～10.00 μg/L 的游離AFB1。經過小鼠生物學鑒定，ELISA檢測可知獲得的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多克隆抗體可產生滴度較高的Ab3抗體，證實為Ab2β型。

該研究通過抗總黃曲霉毒素單抗F(ab’)2片段免疫日本大耳白兔制備出的模擬AFB1內影像的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨特型多抗，可作為AFB1的替代物，為進一步研究和開發具有我國自主知識產權的無毒檢測試劑盒積累了重要資料。

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