五倍子酸對小鼠胃癌MFC和肝癌H22細胞增殖的抑制作用

王麗萍，曾憲旭，牛鳳蘭，石 卓

1)鄭州大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室 鄭州 450001

2)吉林大學基礎醫學院藥理學教研室 長春 130021

3)鄭州大學第三附屬醫院病理科 鄭州 450052

4)吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 長春 130021

近年來，通過無毒或毒性較低的植物制劑進行化學治療已經成為治療惡性腫瘤的方法之一[1]，許多天然來源的植物成分在生物系統和動物模型中已顯示出具有化學預防和治療的作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一種具有抗氧化活性的天然化合物[2]，廣泛存在于植物中，最初作為抗氧化劑用于防止脂肪等食物腐敗。藥理研究[3]表明，GA不僅具有抗炎、抗菌、抗過敏的活性，且對多種腫瘤細胞具有抑制作用[4-6]。該實驗以小鼠胃癌MFC細胞和肝癌H22細胞荷瘤小鼠為實驗模型，觀察GA對上述2種細胞生長的抑制作用，并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 MFC細胞和H22細胞瘤株引自吉林省腫瘤研究所，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液傳代培養，待細胞生長到對數生長期時使用。GA由吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室提供，用于體外實驗時以二甲基亞砜(DMSO)溶解，用于體內實驗時用5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶解。四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司。胎牛血清購自杭州四季青生物公司，青霉素、鏈霉素和DMEM培養基購自Gibco公司。昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，由吉林大學動物中心提供。

1.2 GA體外對2種細胞生長抑制率的MTT法測定 將處于對數生長期的MFC及H22細胞調整密度為1×105mL－1，接種于96孔細胞培養板，24 h后，分別加入不同質量濃度的GA，使其終質量濃度分別為 100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/L，設在培養液中加入 DMSO為對照組。每組設3個復孔，置37℃、體積分數5%CO2飽和濕度的培養箱中培養48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 溶液 20 μL，繼續培養 4 h，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，于570 nm波長處測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[(1－A(給藥孔)/A(對照孔)]×100%。

1.3 GA體外對2種細胞周期及凋亡的影響 取對數生長期的MFC及H22細胞接種于6孔板中，培養24 h，加入 GA，使其終質量濃度為 25.00、12.50和6.25 mg/L，并設在培養液中加入DMSO為對照組。培養48 h，收集細胞，離心，棄上清，用PBS離心洗滌2次，加入體積分數70%冷乙醇于4℃固定12 h，離心洗滌后加入 200 μL PI染液，50 μL RNA酶，4℃避光放置20～30 min，1500 r/min離心5 min。調整細胞濃度為(1～10)×10 mL－1，上流式細胞儀分析。

1.4 GA對荷瘤小鼠抑瘤率的影響 2種細胞的抑瘤實驗相同。取50只昆明小鼠，用無菌生理鹽水調整瘤細胞濃度為5×106mL－1，于小鼠右腋皮下接種MFC細胞懸液，每只0.2 mL，24 h后采用隨機數字表法分5組，每組10只。GA高劑量組(GA 0.50 g/kg)，GA 中劑量組(GA 0.25 g/kg)，GA低劑量組(GA 0.20 g/kg)，環磷酰胺組(環磷酰胺30.00 mg/kg)，生理鹽水組。實驗組及生理鹽水組經灌胃給藥，1次/d;環磷酰胺組經腹腔給藥，隔天1次;連續給藥10 d。于給藥結束次日頸椎脫臼處死全部動物，剝取瘤組織稱量，計算抑瘤率。抑瘤率 =(1－實驗組瘤質量/對照組瘤質量)×100%

1.5 統計學處理 采用SPSS 15.0進行分析。應用單因素方差分析及Dunnet t檢驗比較各組細胞增殖抑制率、細胞周期分布、荷瘤小鼠瘤質量及抑瘤率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 GA對 MFC及H22細胞的抑制作用 見表1。

表1 GA對MFC及H22細胞增殖的抑制作用 %

2.2 GA對MFC細胞周期、凋亡及H22細胞周期的影響 隨GA質量濃度的增加，2組細胞均發生G1/G0期阻滯;隨GA質量濃度的增加，MFC細胞的凋亡也逐漸增多，而H22細胞凋亡率無變化，見表2、3。

表2 GA對MFC細胞周期和凋亡的影響 %

表3 GA對H22細胞周期的影響 %

2.3 GA對荷瘤小鼠瘤質量及抑瘤率的影響 見表4。

表4 GA對荷瘤小鼠瘤質量及抑瘤率的影響

3 討論

早在20世紀90年代，有學者[4-6]初步證實GA具有誘導細胞凋亡作用，后來人們又相繼證實其在體外對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并初步探討了其作用機制。但這些研究大多致力于體外抗腫瘤活性及其機制的初步探討。

作者以MFC和H22細胞作為實驗材料，證實了GA具有體外抑制它們生長的作用，并且呈現良好的劑量-效應關系。GA對MFC和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長表現出明顯的抑制作用。作者的研究結果顯示雖然在同等劑量下GA的抑瘤效應不如環磷酰胺，但GA與環磷酰胺相比有2個優點:一方面GA對腫瘤細胞具有選擇性作用[7-8]，另一方面GA對整體動物的毒性低[9]。

多數腫瘤的發生不僅由于細胞增殖速度快，而且與細胞死亡速度有關。細胞凋亡參與了癌癥的起始過程，并對癌的發生起負調控作用。細胞周期的控制是細胞增殖的主要調節機制，一些細胞毒性藥物通過阻滯細胞周期，進而抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[10]。作者觀察了GA對MFC和H22細胞周期分布的影響，結果顯示其可將MFC細胞阻滯于G0/G1期，誘導MFC細胞凋亡，提示GA對MFC細胞的抑制作用可能是通過對該細胞的G0/G1期周期阻滯作用和誘導凋亡作用實現的。GA可使H22細胞發生G0/G1期阻滯，但未見明顯的凋亡增加，提示細胞周期阻滯是GA抑制H22細胞增殖的主要原因之一，但增殖抑制作用并非通過促進凋亡實現。

[1]呂喆，牛鳳蘭，郗艷麗，等.三羥基苯甲酸純化物及其化合物對Jurkat細胞周期進程及凋亡的影響[J].吉林大學學報:醫學版，2010，36(5):904

[2]Rasool Mk，Sabina EP，Samya SR，et al.Hepatoprotective and antioxidant effects of gallic acid in paracetamol-induced liver damage in mice[J].J Pharm Pharmacol，2010，62(5):638

[3]Hsu JD，Kao SH，Ou TT，et al.Gallic acid induces G2/M phase arrest of breast cancer cell MCF-7 through stabilization of p27Kip1attributed to disruption of p27Kip1/Skp2 complex[J].J Aqric Food Chem，2011，59(5):1996

[4]You BR，Moon HJ，Han YH，et al.Gallic acid inhibits the growth of HeLa cervical cancer apoptosis and/or necrosis[J].Food Chem Toxicol，2010，48(5):1334

[5]Giftson JS，Javanthi S，Nalini N.Chemopreventive efficacy of gallic acid，an antioxidant and anticarcinogenic polyphenol，against 1，2-dimethyl hydrazine induced rat colon carcinogenesis[J].Invest New Drugs，2010，28(3):251

[6]Ji BC，Hsu WH，Yang JS，et al.Gallic acid induces apoptosis via caspase-3 and mitochondrion-dependent pathways in vitro and suppresses lung xenograft tumor growth in vivo[J].J Aqric Food Chem，2009，57(16):7596

[7]Isuzugawa K，Ogihara Y，Inoue M.Different generation of inhibitors against gallic acid-induced apoptosis produces different sensitivity to gallic acid[J].Biol Pharm Bull，2001，24(3):249

[8]Isuzugawa K，Inoue M，Ogihara Y.Catalase contents in cells determine sensitivity to the apoptosis inducer gallic acid[J].Biol Pharm Bull，2001，24(9):1022

[9]Rajalakshmi K，Devaraj H，Niranjali Devaraj S.Assessment of the no-observed-adverse-effect level(NOAEL)of gallic acid in mice[J].Food Chem Toxicol，2001，39(9):919

[10]周執芬，周云，劉明月.紫杉醇聯合替尼泊苷對胃癌BGC-823細胞增殖和凋亡的影響[J].鄭州大學學報:醫學版，2009，44(5):942