細胞直接共培養模型在大鼠肺成纖維細胞轉分化中的應用*

曾 鑫，王永星，姚 武，付曉麗，郝長付#

1)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

2)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學與職業病學教研室 鄭州 450001

轉分化是指一種分化完全的細胞由于某些因素作用，丟失其原有表型特點而轉變為其他類型細胞的一種特定的生理或病理過程[1]。在矽肺發生過程中，SiO2可刺激肺泡巨噬細胞分泌各類活性介質，尤其是轉化生長因子TGF-β1，誘導肺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，其α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及膠原蛋白(COL)表達上調，凋亡受到抑制，促進細胞增殖和膠原合成，最終引起肺纖維化[2-3]。以往在肺成纖維細胞轉分化的研究中多采用細胞間接共培養法即將巨噬細胞、成纖維細胞分別培養，再用巨噬細胞上清刺激成纖維細胞。細胞直接共培養方法則是借助Trans-well小體將兩種細胞進行共培養。該研究中作者分離了SD大鼠肺巨噬細胞和成纖維細胞，采用ThinCertTM建立直接共培養模型，加入不同質量濃度的SiO2，觀察肺成纖維細胞轉分化的過程，確定直接共培養模型的價值，為進一步研究肺成纖維細胞轉分化的表觀遺傳學調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級成年雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2010-0002。游離SiO2粉塵標準品(粒徑為1～5 μm，美國Sigma公司)，180℃恒溫下烘烤4 h，用DMEM培養液(索萊寶公司)制成粉塵懸液(1 g/L)，4℃貯存備用。

1.2 大鼠肺成纖維細胞的提取和純化 參照嚴玉蘭等[4]方法。

1.3 大鼠肺巨噬細胞的提取、純化和活性鑒定 參照丁煥然等[5]的方法提取大鼠肺巨噬細胞，然后加入不同質量濃度的SiO2粉塵懸液處理，采用MTT法檢測巨噬細胞活性，確定后續實驗中SiO2的質量濃度。

1.4 ThinCertTM共培養 取5～8代的成纖維細胞接種于6孔板，細胞生長融合至80% ～90%時，在ThinCertTM內接種約1×106個巨噬細胞，懸掛于6孔板孔內。

1.5 實驗分組 實驗分4組:空白組加入無SiO2粉塵的培養基;SiO2低、中、高劑量組在ThinCertTM內加入終質量濃度分別為25、50和100 mg/L的SiO2粉塵懸液，每孔2 mL，放入培養箱中，37℃、體積分數5%CO2及飽和濕度條件下培養24 h。

1.6 大鼠肺成纖維細胞α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的檢測 采用real time-PCR。用Trizol法提取大鼠成纖維細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA。內參GAPDH引物序列為上游5’-GGTGCTGAGTAT GTCGTGGAGT-3’，下 游 5’-CAGTCTTCTGAGTG GCAGTGAT-3’，產物292 bp;α-SMA引物序列上游5’-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3’，下游 5’-GGG AGCATCATCACCAGCAA-3’，產物 127 bp;COLⅠ引物序列，上游5’-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3’，下游 5’-GGGACCCTT AGGCCATTGTGTA-3’，產物 119 bp;COLⅢ引物上游 5’-TTTGGCACAG CAGTCCAATGTA-3’，下 游 5’-GACAGATCCCG AGTCGCAGA-3’，產物121 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。反應體系20 μL:cDNA 模板 1 μL，Priemix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為:95℃10 min，95℃10 s，59℃(GAPDH)或58℃(α-SMA)或58℃(COLⅠ)或57℃(COLⅢ)30 s，72℃ 30 s，40個循環。每個樣品平行測定3 次，用 2－ΔΔCt法計算目的基因的表達量。

1.7 培養上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ蛋白的檢測 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。收集培養上清，按試劑盒說明書操作，先用標準品繪制出標準曲線，再求出待測樣品中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ質量濃度。每個樣品平行測定6次。

1.8 統計學處理 采用SPSS 12.0處理數據。4組間肺成纖維細胞中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢmRNA的表達量和培養上清中上述3指標質量濃度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較應用 Dunnet’t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 4組肺成纖維細胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的表達量 見表1。

表1 4組肺成纖維細胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ mRNA的表達量

2.2 4組培養上清中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢ質量濃度的比較 見表2。

表2 4組培養上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ質量濃度的比較 μg/L

3 討論

矽肺是塵肺病中危害最嚴重的一種，長期吸入SiO2粉塵導致肺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞是矽肺發病重要的細胞基礎已為大量國內外研究[2-3，6]所證實。粉塵吸入肺內，最先受到損傷的是肺巨噬細胞，巨噬細胞產生大量的致纖維化細胞因子作用于肺成纖維細胞，產生大量的細胞外基質成分，從而導致肺間質纖維化。而肺成纖維細胞在正常靜息狀態下不具有過度增殖和分泌能力，發生活化、功能改變是細胞轉分化的結果[7]。在肺纖維化發生時，COLⅠ、COLⅢ蛋白的變化成為反映細胞外基質蛋白成分變化的主要指標[8]。成纖維細胞α-SMA、COLⅠ、COLⅢ蛋白含量增加，提示成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，是纖維化的標志。

以往矽肺纖維化研究多采用間接共培養方法[9]，即從肺部分離巨噬細胞進行培養，用SiO2刺激巨噬細胞所得的培養上清液作用于肺成纖維細胞，這種方法在時間與空間上都與體內存在較大的差異。ThinCertTM共培養模型即直接用SiO2刺激ThinCertTM內的巨噬細胞，促進其分泌大量細胞因子(白細胞介素、干擾素、TGF-B1、腫瘤壞死因子-α等)，同步作用于成纖維細胞，這種模型更好地模擬了體內環境。該研究結果顯示，ThinCertTM共培養方式下，SiO2各處理組 α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA和蛋白的表達量均高于對照組，且隨SiO2質量濃度的增加而升高，表明ThinCertTM共培養方式成功模擬了肺成纖維細胞轉分化的過程，用 ThinCertTM共培養方式建立的體外細胞模型在肺成纖維細胞轉分化研究中有應用價值。

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[5]丁煥然，馬小兵，戴麗琴.二氧化硅對大鼠肺泡巨噬細胞和肺成纖維細胞TGF-β1表達的影響[J].工業衛生與職業病，2007，33(4):214

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