大劑量甲強龍對兔髖關節周圍骨組織BMP-2表達的影響

張永樂，王義生，張世清，王 曉

1)河南大學淮河醫院骨科 開封 475000

2)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

臨床上激素性股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)多見，致殘率高[1]。成人激素性ONFH行人工關節置換術的翻修率明顯高于因其他原因的人工關節置換術。骨形態發生蛋白－2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)是一種相對分子質量約為30000的堿性降解糖蛋白，主要生物作用是募集間充質細胞，并誘導其向成骨細胞或成軟骨細胞方向分化。作者觀察了大劑量甲強龍(糖皮質激素)對兔髖臼、股骨頭、股骨近端骨組織病理表現及BMP－2表達的影響，探討激素性ONFH人工關節置換術后翻修率較高的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 健康新西蘭成年大白兔27只，雌雄不限，體質量2.7～3.1 kg，采用隨機數字表法分為3組，每組9只。對照組(C組)每次臀部肌內注射3 mL生理鹽水，1次/d;觀察A、觀察B組臀部肌內注射甲強龍80 mg/kg，1次/d，分別連用3和6 d。注射后第2、4、8周的第1天，每組均取3只兔處死，取雙側髖臼、股骨頭、小轉子高度水平約3 mm厚的股骨近端骨標本，觀測以下指標。

1.2 骨組織病理學觀察 骨標本中性甲醛液固定5 d，EDTA 液(pH7.2)脫鈣，常規制片，HE 染色，進行病理學觀察。同時在高倍視野下計數200個骨陷窩，計算其中空骨陷窩所占的百分比。

1.3 骨組織BMP-2蛋白檢測 采用SABC法免疫組化染色進行BMP－2蛋白檢測。陽性反應信號為棕黃色顆粒樣著色。采用Image－Pro Plus 5.0對染色結果進行積分光密度(IA)測量。選擇目標區域時，去除軟骨外區域和復染細胞核。每張片子選擇3個400倍視野，每個視野測量3次，取其均數，表示BMP－2的表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0進行數據處理。3組空胃陷窩計數及BMP－2表達水平的比較采用3×3析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組病理學觀察結果 對照組骨小梁排列規則整齊，致密飽滿，骨細胞清晰可見，核較大、位于中央，髓腔增生活躍，造血細胞、血管豐富，3個時間點病理表現無明顯變化。觀察A、B組2周時股骨頭和股骨近端可見皮質和骨小梁中空骨陷窩稍增多，髖臼骨變化不明顯;4周時股骨頭、股骨近端可見少量骨質和骨髓出現典型的壞死、溶解，破骨細胞和成骨細胞均少見，空骨陷窩進一步增多，骨小梁變細、紊亂，髖臼骨變化不明顯;8周時股骨頭、股骨近端破骨細胞和成骨細胞更少見，空骨陷窩十分多見，骨小梁稀疏，骨皮質較薄。髖臼部位3組各時間點空骨陷窩計數差異無統計學意義;隨作用時間的延長，2個觀察組股骨頭、股骨近端空骨陷窩計數增加，觀察B組增加更明顯，見表1～3。

2.2 3組BMP-2蛋白的表達 對照組各時間點均可見骨組織大片褐色著色，顏色較深;觀察組2周時與對照組情況大致相同或染色深度略有降低，而4、8周時骨組織染色強度和染色面積均逐漸減小，甚至個別標本中無染色區域(圖1)。隨作用時間的延長，觀察組髖臼、股骨頭及股骨近端BMP－2的表達較對照組明顯降低，觀察B組降低更明顯，見表1～3。

圖1 3組兔股骨頭骨組織BMP-2的表達(SABC，×400)

表1 髖臼空骨陷窩計數及BMP-2的表達(n=3)

表2 股骨頭空骨陷窩計數及BMP-2的表達(n=3)

表3 股骨近端空骨陷窩計數及BMP-2的表達(n=3)

3 討論

ONFH的發病機制一直是學術界爭論的焦點，目前尚無定論，主要有脂肪栓塞學說、骨內壓學說及微血管損傷學說及血管內凝血學說等[2－4]。血液的高凝和(或)高纖溶狀態可引起股骨頭內微血管栓塞，髓內脂肪細胞體積增大、堆積，骨內壓增高，壓迫髓內微血管，加劇股骨頭缺血;同時髓內多能祖細胞活性下降，不能及時補充壞死的骨細胞和修復重建栓塞的微血管，最終導致股骨頭的壞死甚至塌陷。激素性ONFH并不是由單一因素引起，而是多種因素綜合作用的結果。糖皮質激素直接損害成骨細胞、骨細胞和破骨細胞功能，其最終結果是骨形成減少，骨吸收增多，機體對骨微損傷的修復能力下降，骨的脆性增加，導致容易發生病理性骨折，尤其易發生骨壞死。

該實驗中，作者建立了激素性ONFH模型。病理學觀察結果顯示，模型兔股骨頭骨細胞分布不均勻，排列紊亂，可見空骨陷窩;軟骨下骨質局灶性破壞明顯，骨組織結構紊亂，骨細胞分布不均勻，空骨陷窩增多;骨小梁連續性中斷，結構紊亂。模型兔股骨近端髓腔內破骨細胞和成骨細胞少見，血管的數量和直徑均降低，空骨陷窩十分多見，骨小梁斷裂，骨皮質較薄。這種病理改變隨激素用藥時間的延長而愈加明顯。但模型兔髖臼處成骨細胞和破骨細胞減少，骨小梁變細，空骨陷窩增加不明顯。

BMP－2可上調66種基因表達，與多種細胞因子形成BMP－2信號通路，促進成骨細胞分化和骨細胞外基質的合成與分泌，多種細胞因子可通過調節BMP－2 信號通路影響骨代謝[5]。已有研究[6]證實，糖皮質激素可抑制BMP－2的表達，抑制程度與用藥時間和用藥劑量正相關。BMP－2含量減少，可直接造成成骨細胞成骨能力降低，骨質量下降。該實驗中，作者觀察到，模型兔髖臼、股骨頭、股骨近端骨組織中BMP－2表達水平均降低，隨激素用藥時間的延長，這種變化更為明顯。提示激素尤其是大劑量激素對BMP－2的表達有明顯的抑制作用，從而直接影響到成骨能力的強弱，而這極有可能是造成激素性ONFH發生后股骨頭骨形成、骨修復能力明顯不足的重要原因[7]。所以作者認為，大劑量激素可造成髖臼、股骨近端及股骨頭BMP－2表達降低，從而使成骨細胞成骨能力降低，骨質量下降;人工關節植入后，骨應變量減少，骨組織開始吸收并發生明顯結構改變，導致假體松動。這可能是激素性ONFH人工關節置換術翻修率高的原因之一。

[1]李金山，林賀然.創傷性與激素性股骨頭缺血性壞死全髖關節置換療效比較[J].黑龍江醫學，2002，26(8):573

[2]姜文學.2004年國家級股骨頭壞死最新治療進展專題研討會會議紀要[J].實用骨科雜志，2005，11(2):190

[3]Kothapalli R，Ayaay JP，Bian H，et al.Ischaemic injury to femoral head induces apoptotic and oncotic cell death[J].Pathology，2007，39(2):241

[4]楊建平，王黎明，徐燕，等.單次低劑量脂多糖聯合甲基強的松龍誘導股骨頭壞死的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2008，22(3):271

[5]王霖霞，李玉坤.BMP－2信號通路與成骨細胞分化[J].國際骨科學雜志，2009，30(2):132

[6]趙繼軍，楊述華，許偉華，等.不同劑量激素對股骨近端的影響[J].中華實驗外科雜志，2009，26(6):712

[7]王維軍，牛東生.外源性激素致股骨頭壞死VEGF與BMP－2 表達的研究[J].寧夏醫學雜志，2009，31(2):102