靶向mTOR siRNA的合成及對MCF-7細胞mTOR基因表達的影響

張岳燦，翟娜娜

1)寧波天一職業技術學院人體形態學教研室 寧波 315104

2)黃河科技學院人體解剖學與組織胚胎學教研室 鄭州 450052

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指小分子雙鏈RNA轉錄后沉默靶基因的表達。siRNA主要通過特異地與序列互補的mRNA結合，并促進其降解，從而在細胞內發揮基因抑制的作用，最終使靶向基因表達下調。RNAi因其可以高效、特異地抑制靶基因的表達而迅速成為一種非常有效的在真核細胞中研究基因功能的工具，目前已經廣泛地應用于基因功能鑒定、基因表達轉錄后調控等熱門研究領域，同時也為多種疾病特別是腫瘤的基因治療提供了新的思路[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種重要的信號轉導分子，其在感受營養信號、調節細胞生長與增殖中起著關鍵作用[2]。近年來研究[3-7]發現，mTOR 途徑在腫瘤細胞生長的調節中發揮重要作用，mTOR信號通路調節異常與包括乳癌在內的多種腫瘤的形成、細胞惡性轉化相關，已成為腫瘤治療的新靶點。作者設計了靶向mTOR的 siRNA，并觀察其對人乳癌 MCF-7細胞mTOR蛋白及mRNA表達的沉默作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MCF-7細胞系由河南省醫藥科學研究所王慶端研究員惠贈;RPMI 1640培養基購自美國HyClone公司;T7 RiboMAXTMExpress RNAi System、SA-AP、BCIP/NBT購自美國 Promega公司;LipofectamineTM2000脂質體購自上海杰美基因醫藥科技有限公司;mTOR鼠抗人多克隆抗體購自美國SAB公司;siRNA模板及5’端生物素標記mTOR cDNA探針(5’-CTCAGCGGTAAAAGTGTCCCCTGCCA-3’)由北京奧科生物技術有限責任公司合成;免疫細胞化學染色SP試劑盒、胃蛋白酶、預雜交液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 靶向mTOR siRNA的合成 根據已知Gen-Bank mTOR mRNA序列和siRNA的設計原則[4]，利用Promega公司的在線設計尋找靶序列，并針對mTOR基因的434～452位點設計合成寡核苷酸模板，序列見表1。按T7 RiboMAX Express RNAi System說明書操作。將各模板的oligo-1和oligo-2、oligo-3和oligo-4分別互補成DNA雙鏈，2條雙鏈DNA分別轉錄產生siRNA的正義鏈和反義鏈，退火后可得到雙鏈siRNA，經純化后重懸于無RNase的水中，以20 bp DNA Ladder為參照，瓊脂糖凝膠電泳，－80℃保存備用。同時設計合成無義模板，按如上操作得到siRNA-N。

表1 靶向mTOR siRNA轉錄模板序列

1.3 細胞培養及轉染 將MCF-7細胞培養于RPMI 1640培養液(含體積分數10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，鏈霉素 100 mg/L)中，37℃、體積分數5%CO2孵箱內培養。取對數生長期細胞用無抗生素培養液培養，待細胞達80% ～90%融合時分組轉染，分別轉染100和150 nmol/L的 siRNA、siRNAN，正常對照組不轉染。嚴格按LipofectamineTM2000試劑說明書進行操作。轉染24、48和72 h時，收集細胞并調整細胞濃度為 1 ×106mL－1，以 20 μL/片將細胞懸液滴于預處理的載玻片中央，固定備用。

1.4 mTOR蛋白的檢測 取對數生長期細胞，嚴格按照免疫細胞化學染色試劑盒說明書操作。以已知mTOR蛋白陽性表達的食管癌組織作陽性對照[8];以PBS代替一抗作陰性對照。mTOR蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒樣物質，位于胞質內。

1.5 mTOR mRNA的檢測 取對數生長期細胞，經乙醇脫水處理后用體積分數30%H2O21份加純甲醇50份混勻滅活內源性過氧化物酶，Triton X-100/PBS進行透膜，然后用多聚甲醛及 PBS(pH 7.2～7.6，含有1/1000 DEPC) 暴露mRNA 核酸片段。預雜交:滴加20 μL/片雜交液，置濕盒內，42℃預雜交3～4 h。雜交:滴加含標記cDNA探針(0.3～0.6 mg/L)的雜交液于標本上，然后覆蓋蠟膜，42～43℃雜交12～16 h。雜交后處理:在42℃下應用0.1×SSC洗標本15 min×4次，以洗脫非特異性雜交。用SA-AP和BCIP/NBT進行雜交后顯色。以雜交前用RNase處理的樣本作陰性對照，用已知的mTOR mRNA陽性表達的食管癌組織作陽性對照[8]。mTOR原位雜交陽性信號定位于胞質中，呈藍紫色，陽性對照均有陽性信號顯示，陰性對照均無陽性信號顯示。

1.6 結果判定 免疫細胞化學及原位雜交結果判定方法為:觀察10個高倍視野，按陽性細胞數≤10%、≤30%、≤70%和＞70%分別記為1、2、3和4分。按著色強度:胞質內可見淺色顆粒，明顯高于背景底色計為1分;胞質內見較深色顆粒計為2分;胞質內有大量深色顆粒為3分。上述兩種計分的乘積為最后得分。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0進行統計分析，4組3個時間點間MCF-1細胞mTOR蛋白和mRNA表達水平的比較應用4×3析因設計的方差分析，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 4組細胞 mTOR蛋白的表達 見圖1、表2。與siRNA-N轉染組和正常對照組比較，mTOR siRNA轉染組細胞mTOR蛋白的表達均有所降低，但2個mTOR siRNA轉染組之間差異無統計學意義;各組細胞mTOR蛋白表達水平未隨轉染時間的延長而有所變化。

圖1 轉染72 h后各組細胞mTOR蛋白的表達(SP，×400)

表2 4組細胞mTOR蛋白表達水平的比較

2.2 4組細胞 mTOR mRNA的表達 見圖2、表3。與siRNA-N轉染組和正常對照組比較，mTOR siRNA轉染組細胞mTOR mRNA的表達均有所降低，但2個mTOR siRNA轉染組之間差異無統計學意義;各組細胞mTOR mRNA表達水平未隨轉染時間的延長而有所變化。

圖2 轉染72 h后各組細胞mTOR mRNA的表達(ISH，×400)

表3 4組細胞mTOR mRNA表達水平的比較

3 討論

研究[2]表明mTOR是PI3K/AKT/mTOR信號通路下游的重要效應蛋白，它可接收整合生長因子、營養、能量等多種信號，通過PI3K/AKT途徑或AMPK途徑來發揮作用，是調節細胞生長和增殖的中心環節。mTOR還能調控c-myc、cyclinD等多種癌基因的表達，這些過程都與腫瘤的發生密切相關。現已發現[9-10]，大多數惡性腫瘤，如非小細胞性肺癌、腎細胞癌、白血病、鼻咽癌、喉癌、肝細胞癌及前列腺癌等，均伴有mTOR信號通路的調控異常，mTOR信號通路中的相關激酶大都處于激活狀態，這些激酶的激活原因很多，包括PTEN功能缺失、Akt擴增及結節性硬化復合物突變缺失等。mTOR抑制劑雷帕霉素在體內外均可特異性地阻斷mTOR/p70S6K信號通路，下調mTOR的表達并抑制p70S6K和4EBPI的磷酸化，使細胞周期停滯在G1期，抑制癌細胞的增殖，促進其凋亡[11]。由此可見mTOR信號通路在腫瘤的形成和發展中扮演著重要角色，并參與腫瘤的浸潤和轉移[9]。Zhou 等[12]的研究發現，mTOR的表達水平從正常乳腺上皮組織、不典型增生到惡性轉化再到腫瘤浸潤漸次增加。

作者設計并體外轉錄合成靶向mTOR siRNA，轉染人乳癌MCF-7細胞后，運用免疫細胞化學SP法和原位雜交技術檢測細胞mTOR蛋白及mRNA的表達情況。結果顯示，靶向mTOR siRNA處理的MCF-7細胞mTOR蛋白和mRNA的表達均較正常對照組明顯降低。說明該研究中制備的mTOR siRNA可有效抑制乳癌MCF-7細胞mTOR蛋白及mRNA的表達，這為深入研究乳癌的發生發展機制以及腫瘤靶向治療積累了實驗資料。

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