先天性巨結腸患兒結腸肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1的表達

陳 琦，王 志，曹振杰，趙金磊，馮偉樓

鄭州大學第三附屬醫院小兒外科 鄭州 450052

先天性巨結腸(Hirschsprung’s disease，HD)是新生兒期低位腸梗阻的常見原因之一，其病因尚不十分明確。研究[1]表明在整個神經系統的發育中都存在NKX2-1的合成。近年來NKX2-1的研究主要集中在甲狀腺、腦部以及肺部等有關神經系統發育疾病過程[2]，在腸神經的研究較少。作者應用免疫組化SP法和RT-PCR技術檢測NKX2-1在HD患兒結腸壁肌間神經叢內神經節細胞中的表達，進一步了解NKX2-1在HD發病中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源 鄭州大學第三附屬醫院普外科2010年9月至2011年4月臨床確診HD手術患兒30例，其中男21例，女9例。年齡3 d至5歲，中位年齡13個月。長段型4例，常見型19例，短段型7例。分別取患兒結腸的狹窄段、移行段和擴張段用于實驗。同時取30例腸套疊手術患兒切除的正常結腸標本作為對照，其中男19例，女11例，年齡4個月至2歲，中位年齡14個月。

1.2 NKX2-1蛋白的檢測

1.2.1 試劑及方法 采用免疫組化SP染色法檢測。所有標本均經中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，2 μm厚連續切片。一抗為鼠抗人單克隆抗體(稀釋200倍后使用)，由北京博奧森生物技術有限公司提供，二抗和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術服務有限公司，染色步驟嚴格按說明書進行。

1.2.2 結果判定 用Leica病理圖像采集儀器采集圖像，每例標本隨機選取腸壁全層10個高倍視野，觀察肌間神經叢和黏膜下神經叢的染色情況，以結腸神經節細胞胞質內出現特異性棕黃色顆粒為陽性。參照文獻[3]的標準:未著色為陰性(－)、偶見著色為弱陽性(+)、中等著色為陽性(?)、著色豐富為強陽性(?)。

1.3 NKX2-1 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，引物購于北京三博志遠生物技術有限責任公司。NKX2-1引物序列:上游 5’-GCCGAATCATGTCGATGAGTC CA-3’，下游 5’-GTTGCCCAGGTTGCCGTTG-3’，擴增產物大小287 bp。內參GADPH引物序列:上游5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下 游 5’-CAC AGTCTTCTGGGTGGC-3’，擴增產物大小 540 bp。RNA提取、逆轉錄、擴增的步驟均嚴格按照說明書進行。擴增條件為:95℃變性2 min，95℃預變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min共35個循環，最后一個循環72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。NKX2-1 mRNA的相對表達量用目的基因與內參條帶灰度值的比值表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0分析，HD患兒不同節段結腸組織和正常對照組結腸組織中NKX2-1蛋白表達的比較應用兩獨立樣本的秩和檢驗，mRNA相對表達量的比較應用兩獨立樣本的t檢驗或校正t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HD患兒和正常對照結腸組織肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1蛋白的表達 見圖1、表1。

圖1 HD患兒和正常對照結腸肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1蛋白的表達(SP，×400)

表1 HD患兒和正常對照結腸組織肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1蛋白表達比較

2.2 HD患兒和正常對照結腸組織肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1 mRNA的表達 見圖2、表2。

圖2 HD患兒和正常結腸組織肌間神經叢內神經節細胞中NKX2-1 mRNA的表達

表2 HD患兒和正常對照結腸組織和正常結腸組織中NKX2-1 mRNA表達比較

3 討論

HD是一種小兒常見的消化道發育畸形，主要機制是起源于內在神經系統的迷走神經嵴的不正常發育，最后導致腸神經節發育缺陷[4]。組織學可見病變段結腸腸管黏膜下層和肌間神經層內神經節細胞減少或缺如。Agoff等[2]發現，神經嵴細胞中NKX2-1基因表達控制著神經元的分化方向。該基因定位于染色體14q13，其編碼的蛋白產物含有371個氨基酸殘基，相對分子質量為38000，含有3個外顯子和1個內含子，是一個含有螺旋-轉角-螺旋結構的轉錄因子，其變異會導致神經節細胞的缺如，引起HD的發生。NKX2-1與腸神經元的發育有一定的聯系[4-6]?；蛉笔Чδ茉囼炞C實NKX2-1是通過影響中間神經元而實現向不同的方向分化，也可以在不同的程序中終止某一中間神經元的分化，導致中間神經節細胞發育終止。在結腸中NKX2-1主要分布在黏膜下層和肌間神經叢神經節細胞中[4]。

該研究結果表明NKX2-1在正常結腸肌間神經叢神經節細胞中有較高表達，但在HD患兒結腸壁的移行段、狹窄段較正常結腸組織的表達下降。NKX2-1的這種表達不一致的情況可能與腸神經系統的發育成熟有關。

綜上所述，推測NKX2-1是保持正常神經系統發育成熟的重要因素可能與HD的發生有關。

[1]Carré A，Szinnai G，Castanet M，et al.Five new TTF1/NKX2.1 mutations in brain-lung-thyroid syndrome:rescue by PAX8 synergism in one case[J].Hum Mol Genet，2009，18(12):2266

[2]Agoff SN，Lamps LW，Philip AT，et al.Thyroid transcription factor-1 is expressed in extrapulmonary small cell carcinomas but not in other extrapulmonary neuroendocrine tumors[J].Mod Pathol，2000，13(3):238

[3]Burnstock G.Pathophysiology and therapeutic potential of purinergic signaling[J].Pharmacol Rev，2006，58(1):58

[4]Leon TY，Ngan ES，Poon HC，et al.Transcriptional regulation of RET by Nkx2-1，Phox2b，Sox10，and Pax3[J].J Pediatr Surg，2009，44(10):1904

[5]Hamvas A.Evaluation and management of inherited disorders of surfactant metabolism[J].Chin Med J，2010，123(20):2943

[6]Flandin P，Zhao Y，Voqt D，et al.Lhx6 and Lhx8 coordinately induce neuronal expression of shh that controls the generation of interneuron progenitors[J].Neuron，2011，70(5):939