人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)、增殖和遷移

王田蔚，方 樂，馬晶波

（1．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院1．放射線科；2．神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033）

對血管內(nèi)支架進(jìn)行內(nèi)皮化，有可能防止支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。文章采用新鮮臍血中分離的單個核細(xì)胞，在包含堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的環(huán)境中培養(yǎng)及擴(kuò)增，經(jīng)過形態(tài)學(xué)對比，結(jié)合免疫熒光法和流式細(xì)胞儀鑒定貼壁細(xì)胞；并與同期采集的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在增殖和遷移能力兩方面進(jìn)行對比。

1 材料和方法

1．1 材料

研究方案由院屬醫(yī)學(xué)倫理委員會審核并批準(zhǔn)，新鮮臍血標(biāo)本來自我醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的足月妊娠健康產(chǎn)婦，事前均由產(chǎn)婦及家屬授權(quán)。

1．2 試劑與檢測儀器

人淋巴細(xì)胞分離液（LSM，美國 Mp bio公司）；M199培養(yǎng)液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，美國Pepro Tech公司）；Dil標(biāo)記乙酰化低密度脂蛋白（Dil－acLDL，Molecular probes公司）；人纖維連接蛋白、FITC 標(biāo)記荊豆凝集素I（FITC－UEA－I，Sigma－aldrich 公 司 ）；FITC－CD34、PE－CD133（美 國eBioscience公司）；PerCP／Cy5．5－VEGFR－2（美國BioLegend公司）；CCK－8（日本同仁化學(xué)研究所）；Transwell小室（美國Costar公司）；倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）；酶標(biāo)儀（美國THERMO公司）。

1．3 實驗方法

單個核細(xì)胞的分離：無菌離心管（預(yù)抗凝）采集臍血50ml；按1∶2的比例將PBS等倍稀釋后的臍血沿離心管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液上，離心25 min（500g／min），離心后將交界處混濁灰白色的單個核細(xì)胞層小心吸出，在以M199培養(yǎng)液離心洗滌2次（300g／min）。

向EPCs的誘導(dǎo)分化：首先用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液重懸的單個核細(xì)胞（培養(yǎng)液包括含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，VEGF10μg／L，bFGF10μg／L，青霉素100U／ml，鏈霉素100U／ml），再將其接種到24孔培養(yǎng)板（5mg／L人纖維連接蛋白包被），置孵育箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2），3天后首次換液，每3天更換1次，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%后胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終對比觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，同時進(jìn)行生物學(xué)檢測。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）分離與培養(yǎng)：新生兒臍帶，0．25%胰蛋白酶（37℃預(yù)熱）灌注臍靜脈腔，37℃孵箱消化20min，終止消化，重懸細(xì)胞，并接種以及傳代（條件同向EPCs的誘導(dǎo)分化）。

EPCs吞噬DiI－ac－LDL以及結(jié)合FITC－UEA－I的功能鑒定：培養(yǎng)至第7天時取爬片的貼壁細(xì)胞，按比例（3mg／L）加入 Dil－ac－LDL，孵育箱孵育4h（5%CO2、37℃），20g／L多聚甲醛固定，再次洗滌后加入FITC－UEA－I（10mg／L），37℃孵育1h，最終經(jīng)DAPI對比染色后激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行鑒定。

EPCs表型鑒定：分別于培養(yǎng)至第7和28天時用流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后重懸細(xì)胞（細(xì)胞濃度為109L－1），加入 PE－CD133、FITCCD34和 PerCP／Cy5．5－VEGFR－2抗體，混勻后孵育30min（4℃并避光）。PBS洗去未結(jié)合的抗體，重懸后流式細(xì)胞儀檢測（以未加抗體的細(xì)胞為陰性對照）。

增殖能力對比：分別接種EPCs和HUVECs于96孔板（兩種細(xì)胞密度相同），每組均隔日取3孔利用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖數(shù)量，連續(xù)監(jiān)測7個時間點（1－14天）并最終繪制細(xì)胞生長曲線。

細(xì)胞遷移能力對比：對比利用24孔transwell小室（8μm孔徑）進(jìn)行，上室加200μL的 M199培養(yǎng)液（含EPCs或HUVECs）；下室加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液孵育24h（37℃），擦去附著細(xì)胞，經(jīng)染色后顯微鏡下計數(shù)，最終經(jīng)醋酸脫色后將洗脫液用酶標(biāo)儀測570nm吸光度值；本項實驗重復(fù)3次。

本實驗主要觀察指標(biāo)：①人臍血EPCs形態(tài)觀察。②人臍血EPCs鑒定。③人臍血EPCs與HUVECs在體外增殖和遷移能力。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17．0，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗進(jìn)行，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 單個核細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)分離洗滌后的單個核細(xì)胞呈懸浮的小圓形；至培養(yǎng)第3天時細(xì)胞明顯貼壁并出現(xiàn)細(xì)胞集落；至第7天左右特征性克隆形成，細(xì)胞群的中央部分為圓形細(xì)胞，周圍部分由梭形細(xì)胞放射狀分布；至第14天左右，貼壁細(xì)胞多呈梭形，并出現(xiàn)線樣排列，體積逐漸變大的同時邊界逐漸清楚；至第28天，基本細(xì)胞長滿底部，此時細(xì)胞呈“鋪路石樣”排列。

貼壁細(xì)胞熒光染色

攝取Dil－ac－LDL后細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為紅色，經(jīng)過FITC－UEA－I染色的細(xì)胞鏡下表現(xiàn)為綠色，經(jīng)DAPI復(fù)染后鏡下細(xì)胞核為藍(lán)色，上述三種染色均表現(xiàn)為陽性的正分化的EPCs，本實驗陽性率大于90%。

流式細(xì)胞儀分析

經(jīng)過7天培養(yǎng)后細(xì)胞的CD133、CD34和VEGFR－2表達(dá)分別占29．3±4．8%，51．7±7．5%和68．2±8．1%。培養(yǎng)28天的細(xì)胞CD34和VEGFR－2的表達(dá)分別占7．9±3．8%和78．2±6．5%，此時未見CD133表達(dá)。

2．2 細(xì)胞增殖對比

經(jīng)過CCK－8試劑盒檢測到的細(xì)胞增殖數(shù)量對比見增殖曲線（圖1），其中EPCs從培養(yǎng)第7天開始增殖速度明顯高于HUVECs，擴(kuò)增后細(xì)胞數(shù)量可達(dá)109L－1。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線

細(xì)胞遷移能力比較

EPCs遷移的細(xì)胞數(shù)明顯多于HUVECs，表明EPCs遷移能力占優(yōu)（P＜0．05）。兩者吸光度值分別為0．283±0．03和0．269±0．02。

3 討論

Asahara等［1］1997年首次從人類外周血中分離出EPCs，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，有可能預(yù)防血管支架內(nèi)再狹窄，因此具有非常重要的臨床意義。EPCs的常見來源為骨髓、臍血和外周血。其中骨髓來源創(chuàng)傷和風(fēng)險較大；外周血來源的含量極低，僅占單個核細(xì)胞總數(shù)的0．002%；臍血來源中的EPCs含量約為外周血的10倍［2］，且來源廣泛，采集簡便，對供者無不良影響，不涉及倫理學(xué)問題，較為理想。

復(fù)習(xí)以往文獻(xiàn)，常用的EPCs分離方法是免疫磁珠分選法和密度梯度離心法。免疫磁珠分選法獲得的EPCs純度較高，但數(shù)量非常少，單獨培養(yǎng)難以大量增殖，且操作較復(fù)雜，價格昂貴，其實驗環(huán)境容易被污染，對培養(yǎng)中細(xì)胞的活性影響較大。相反，雖然密度梯度離心法獲得的細(xì)胞純度不高，但通過培養(yǎng)中貼壁篩選法仍可獲得較高的純度的EPCs，且經(jīng)濟(jì)性好，可重復(fù)性較強(qiáng)。本實驗采用密度梯度離心法為基礎(chǔ)，獲得的實驗結(jié)果令人滿意。

EPCs的鑒定方法差異很大，根本原因在于EPCs缺乏特異性的表面標(biāo)記。復(fù)習(xí)以往文獻(xiàn)，多數(shù)研究中的鑒定是通過細(xì)胞攝取Dil－ac－LDL，經(jīng)過FITC－UEA－I染色包括DAPI復(fù)染和（或）應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析CD34＋、CD133＋、VEGFR－2＋表達(dá)兩種手段進(jìn)行。一部分學(xué)者［3］認(rèn)為正分化的EPCs能夠同時吸收 Dil－ac－LDL和結(jié)合 FITC－UEA－I；另一部分注重細(xì)胞功能的學(xué)者［2］認(rèn)為能表達(dá)CD34、VEGFR－2和CD133的細(xì)胞是功能性內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并通過對心臟醫(yī)用植入假體上被覆的新生內(nèi)膜進(jìn)行研究加以證實。本實驗結(jié)合兩種方案設(shè)計，綜合不同分離、培養(yǎng)和鑒定方法的優(yōu)缺點，既觀察吸收 Dil－ac－LDL和結(jié)合 FITC－UEA－I的能力來判斷細(xì)胞類型及細(xì)胞功能，又應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型鑒定時結(jié)果顯示：經(jīng)誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞表面的CD133表達(dá)迅速下降最終于培養(yǎng)28天時消失；與之對應(yīng)CD34和VEGFR－2等成熟內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志始終有表達(dá)，形態(tài)學(xué)觀察顯示最終分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)有的“鵝卵石樣”典型形態(tài)。本實驗結(jié)果表明EPCs經(jīng)誘導(dǎo)可定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，這與已有文獻(xiàn)報道相一致［4－7］，表明前述方法可以獲取較高純度和同源性的EPCs。

EPCs具有遲發(fā)高增殖潛能，這是功能上區(qū)別于成熟內(nèi)皮細(xì)胞的主要特性。在體外環(huán)境下成熟內(nèi)皮細(xì)胞4－6周后增殖能力明顯下降；而EPCs在培養(yǎng)15－20天后形成的內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)學(xué)呈迅速生長的典型“鵝卵石”樣排列，此形態(tài)學(xué)特征能穩(wěn)定傳30代以上。既往研究表明EPCs在適宜的條件下可以快速增殖、分化，增殖的能力可以達(dá)到內(nèi)皮細(xì)胞的10倍以上［8］，短時間培養(yǎng)即可達(dá)到覆蓋血管支架表面所需的數(shù)量。通過對EPCs和HUVECs的增殖和遷移能力進(jìn)行對比分析，本實驗結(jié)果也提示EPCs可以快速增殖、分化，增殖能力明顯優(yōu)于HUVECs，且遷移能力也明顯優(yōu)于后者，這為EPCs應(yīng)用于血管支架材料提供了理論依據(jù)。

綜上所述，結(jié)合密度梯度離心法和貼壁篩選法分離、純化臍血來源EPCs，經(jīng)適當(dāng)環(huán)境誘導(dǎo)分化，可向成熟內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成的內(nèi)皮細(xì)胞具有迅速生長的形態(tài)學(xué)特征且能穩(wěn)定傳代，在體外環(huán)境中可大量擴(kuò)增。EPCs可能成為預(yù)防血管支架內(nèi)再狹窄的理想被捕獲細(xì)胞來源。

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