RNA干擾COPS3表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖影響的分析

孔慶彧，崔久嵬，于得海，李 薇，王雪梅，2，王冠軍＊

（1．吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春130021；2．吉林省人民醫(yī)院 血液科）

肺癌為死亡率最高的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)死亡率仍呈逐年上升趨勢。近年來隨著對腫瘤發(fā)生研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)并證實腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移根本原因在于相關(guān)基因的異常表達(dá)，尤其是調(diào)控細(xì)胞生長與分化的癌基因的激活或抑癌基因的失活更成為腫瘤發(fā)生機制研究的熱點［1］。COPS3（constitutive photomorphogenic homolog subunit 3 of COP9）是新近發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，是腫瘤治療的潛在靶點。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效、特異地降解靶基因mRNA的實驗技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于基因功能領(lǐng)域的研究［2，3］。

本研究通過建立COPS3慢病毒RNAi載體，觀察干擾COPS3基因表達(dá)后，肺癌細(xì)胞A549增殖、周期分布及細(xì)胞凋亡情況，以探討其在肺癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1．1 主要材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549、人胚胎腎上皮細(xì)胞株293T（ATCC）；表達(dá)載體 pFH1UGW－GFP（上海Hollybio公司）；慢病毒載體及輔助載體（上海吉凱基因 技 術(shù) 公 司）；M－MLV 反 轉(zhuǎn) 錄試劑 盒 （Promega）；ECL試劑（Amersham）；COPS3兔抗小鼠單克隆抗體、β－actin兔抗小鼠多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗抗體（Snata Cruz）。

1．2 COPS3基因的RNA干擾

1．2．1 RNAi慢病毒載體構(gòu)建 針對COPS3基因mRNA序列，通過“Target Finder Tool”軟件（Gen－Scrip）設(shè)計干擾序列及對照序列（表1）。單鏈DNA退火后產(chǎn)生雙鏈DNA oligo，再與雙酶切后的慢病毒干擾載體連接，進而轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑單克隆進行PCR鑒定；對陽性菌落進行測序。

1．2．2 慢病毒包裝及感染細(xì)胞 293T細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時開始轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine 2000說明書，在6孔板中加入si－COPS3或si－CTRL 2 μg、pCMV載體1．5μg、pVSVG載體1μg。轉(zhuǎn)染后8h更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，在此期間觀察轉(zhuǎn)染效率。最后收集上清液，進行過濾、濃縮并測定病毒滴度。

表1 COPS3基因干擾序列

以5×104細(xì)胞／孔將A549細(xì)胞接種于96孔板，以含有適量病毒的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1．2．3 慢病毒感染后COPS3基因沉默分析 收集慢病毒感染5d的A549細(xì)胞，分別應(yīng)用real－time PCR及Western blot法分析檢測慢病毒感染A549細(xì)胞后COPS3mRNA及蛋白表達(dá)水平。

1．3 BrdU法檢測細(xì)胞增殖

收集慢病毒感染5d的A549細(xì)胞，按5×103細(xì)胞／孔接種于96孔板，檢測時間設(shè)為接種后24h和72h。調(diào)整每孔BrdU終濃度為25μmol／l，繼續(xù)培養(yǎng)8h，固定細(xì)胞并用核酸酶室溫消化30min后加入BrdU單克隆抗體（1∶200稀釋）與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1．5h，然后加入TMB顯色底物，暗處孵育30min后終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取490nm處OD值。

1．4 細(xì)胞周期分析

收集慢病毒感染細(xì)胞以1×106個細(xì)胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞并固定，加入配制的PI溶液（100μg／ml PI，10μg／ml RNase A）染色30min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞周期分析。

1．5 細(xì)胞凋亡檢測

取慢病毒感染細(xì)胞以5×105個細(xì)胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)5d，消化并收集細(xì)胞，分別加入100μl結(jié)合緩沖液、5μl Annexin V 溶液及5μl PI，于暗處室溫孵育5min。取1×106個細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞凋亡分析。

1．6 統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值ˉx±SD表示，每組實驗重復(fù)三次。數(shù)據(jù)采用SPSS16．0軟件進行pairedt檢驗，P≤0．05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 慢病毒感染A549細(xì)胞

將慢病毒感染A549細(xì)胞96h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，可見明顯綠色熒光，證明病毒表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，感染效率可達(dá)50%以上（圖1）。

圖1 慢病毒感染A549細(xì)胞96h后GFP表達(dá)情況（×200）

2．2 RNAi COPS3基因沉默效果驗證

與對照組相比，轉(zhuǎn)染si－COPS3的A549細(xì)胞COPS3mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著下降（圖2，3）。

2．3 干擾COPS3表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的影響

BrdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，與對照組相比，si－COPS3轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞72h后細(xì)胞增殖顯著受抑（圖4）。

圖2 Real－time PCR分析轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后A549細(xì)胞COPS3mRNA表達(dá)情況

圖3 Western blot分析轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后A549細(xì)胞COPS3蛋白質(zhì)表達(dá)水平

圖4 BrdU法分析干擾COPS3基因表達(dá)后A549細(xì)胞增殖情況

2．4 COPS3基因沉默對A549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，與對照組不同，COPS3基因沉默后細(xì)胞周期大多停滯于G0／G1期（圖5A、B）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析干擾COPS3基因后A549細(xì)胞周期情況（A）及其定量分析（B）

2．5 COPS3基因沉默對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng) Annexin V－PI雙染后的A549細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，實驗組凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對照組（圖6A、B）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)分析干擾COPS3基因后A549細(xì)胞凋亡情況

3 討論

近年來，腫瘤治療分子靶點的探索及相應(yīng)藥物研發(fā)成為抗腫瘤新藥研發(fā)的前沿和熱點［3］。

COPS3基因是高度保守COP9信號傳導(dǎo)通路中的一部分，位于人染色體17p11．2。該基因能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)諸多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移等［4，5］。Dartel等［5］通過 DNA微陣列法亦發(fā)現(xiàn)COPS3基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)；Yan等［6］研究發(fā)現(xiàn)該基因在高度惡性骨肉瘤組織中高表達(dá)，而當(dāng)COPS3過表達(dá)后抑制p53基因，可促進腫瘤細(xì)胞生長，敲除COPS3基因后，可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。

慢病毒載體具有十分廣泛的宿主范圍，分裂期及非分裂細(xì)胞均能感染，并且能夠?qū)⑤^大的外源基因片段有效地整合至宿主基因組中，是目前較為理想的基因轉(zhuǎn)移載體之一［7］。本實驗以慢病毒為載體，成功建立了COPS3的干擾體系，并將其導(dǎo)入肺癌細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)通過干擾COPS3基因表達(dá)，肺癌細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，并可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0／G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示COPS在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用。

本研究為進一步深入探討COPS3基因沉默后在肺癌發(fā)生與發(fā)展過程中的機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

［1］Skrzypski M，Dziadziuszko R，Jassem J．MicroRNA in lung cancer diagnostics and treatment［J］．Mutat Res，2011，717（1）：25．

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