間充質干細胞和內皮祖細胞對臍血造血干／祖細胞體外擴增效力的影響

遲 玥，段海峰，于 庭＊

（1．吉林大學第二醫院，吉林 長春130041；2．軍事醫學科學院 放射與輻射研究所，北京100850）

近年來，臍血造血干細胞（HSCs）移植倍受關注，但由于臍血中HSCs數量不足以及輸注后產生的成熟細胞生物動力欠佳等因素，使臍血HSCs移植的應用受到了限制。因此，許多學者致力于HSCs體外擴增的研究，尋求適宜的HSCs體外擴增環境，提高臍血HSCs質量成為亟待解決的問題。

間充質干細胞（MSCs）是最早發現于骨髓基質中的一種多能干細胞，它具有多向分化潛能、能形成有利于HSCs生長的微環境［1］，可以分泌與 HSCs生長相關的黏附分子、細胞外基質和多種細胞因子［2］，支持造血并促進HSCs體內植入。內皮祖細胞（EPCs）是血管內皮細胞的前體細胞，近期發現該細胞也是構成HSCs微環境的成員之一，并通過分泌干細胞因子（SCF）等多種因子影響HSCs的增殖和自我更新［3］。此外已有研究表明，人臍帶沃頓膠中分離出的MSCs可衍生為EPCs［4］，EPCs可分泌細胞因子調節MSCs的活性［5］，并且MSCs與EPCs可互為對方的生長微環境，影響對方細胞的增殖和分化［6］。故MSCs、EPCs以及HSCs三者的關系是近年研究的熱點和趨勢。

雖然目前國內外已分別研究了MSCs及EPCs對HSCs體外擴增的影響，但尚未闡明兩者對HSCs作用的差異性。因此，本研究通過將MSCs、EPCs作為滋養層細胞，與HSCs／HPCs接觸共培養，比較兩者對HSCs／HPCs擴增能力、表面抗原CD34的表達以及集落形成能力的作用差異性，為尋求一個更適合HSCs體外大量擴增的微環境奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞和臍帶血 臍帶間充質干細胞由軍事醫學科學院放射與輻射研究所分離及鑒定；內皮祖細胞由解放軍307醫院CTC中心實驗室惠贈；臍血由北京中西醫結合醫院產科提供。

1．1．2 試劑 甲基纖維素、胰蛋白酶為Sigma公司產品；人淋巴細胞分離液為天津TBD公司產品；胎牛血清、臺盼藍染液為Gibco公司產品；Iscovo’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、Minimum Essential Medium Alpha Medium（α－MEM）為Invitrogen 公 司 產 品；Endothelial Cell Medium（ECM）為Sciencell公司產品；絲裂霉素C（mitomycin C）為INALCO公司產品；甲基纖維素半固體培養基（MethoCultTMH4434）為 StemCell Technologies公司產品；抗人CD34－PE、抗人CD45－FITC為BD pharmingen公司產品；EDTA為國藥集團化學試劑有限責任公司產品；HEPES為Ameresco公司產品。

1．2 方法

1．2．1 臍帶血MNCs的分離和鑒定 無菌采集健康產婦足月妊娠的臍血標本，當日分離。以臍血：PBS：0．5%甲基纖維素＝1∶3∶1的比例混合。室溫靜置30min。小心吸取上清離心，1 600rpm，10 min，22℃，得有核細胞。所得有核細胞用10倍以上體積 PBS洗滌一次，離心，1 500rpm，6min，22℃。重懸于5ml PBS，混勻。在15ml離心管底部加入5－10ml人淋巴細胞分離液，將細胞懸液小心加入其上。離心1 500rpm，30min，22℃。小心取出離心管，溶液分為3層：從上至下依次是透明的PBS層，單個核細胞層，紅細胞層。吸出單個核細胞層，加入30ml PBS混勻，1 500rpm，5min離心洗滌；再用10ml PBS同條件離心再洗滌一次。棄上清后沉淀為所需MNCs，為共培養和鑒定備用。

計數后，用抗人CD34－PE和抗人 CD45－FITC雙色標記106個細胞，FACS Calibur流式細胞儀檢測其中CD34＋CD45－的細胞所占比例。

1．2．2 滋養層細胞的制備 4－6代 MSCs接種在含α－MEM（含人血小板裂解物［7］）培養液的培養皿中，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養箱中培養，每2天換液一次，至80%－90%融合時，0．05%胰蛋白酶消化傳代，細胞鋪于6孔板（Corning公司）中的兩個孔，每孔2×105個細胞。加入2mlα－MEM培養液按上述條件培養至80%－90%融合。吸出培養基后，每孔用無血清IMDM洗兩次，加入終濃度為10μg／ml的絲裂霉素C，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養箱中培養2．5h，無血清IMDM洗3次，作為MSCs滋養層備用［8］。

4－6代EPCs接種在含ECM完全培養液的培養皿中，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養箱中培養，每2天換液一次，至80%－90%融合時，0．05%胰蛋白酶消化傳代，細胞鋪于6孔板中的兩個孔，每孔2×105個細胞。加入2ml ECM培養液按上述條件培養至80%－90%融合。吸出培養基后，每孔用無血清IMDM洗兩次，加入終濃度為2．5μg／ml的絲裂霉素C，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養箱中培養2．5h，無血清IMDM洗3次，作為EPCs滋養層備用。

1．2．3 MSCs和EPCs分別與 MNCs共培養 共培養分為3組：對照組（無滋養層），MSC組（MSC細胞滋養層），EPC組（EPC細胞滋養層），每組2個復孔。加入新分離的 MNC105個細胞／孔，每孔加入2ml含10%胎牛血清的IMDM培養基。共培養2－3d半換液一次，并將所有 MNCs轉移至相應的絲裂霉素C處理后的滋養層繼續培養。分別在共培養第0d、4d、7d觀察顯微鏡下每孔細胞增殖情況并拍照，并用4%臺盼藍染液以1∶1比例染色后計數每孔活細胞數。

1．2．4 流式細胞術分析 吸出共培養7d后的各孔細胞，用抗人CD34－PE和抗人CD45－FITC抗體雙色標記細胞，FACS Calibur流式細胞儀檢測3組MNCs的CD34＋CD45－細胞所占比例。每組各設一個對照管和一個樣本管。

1．2．5 造血祖細胞集落分析 實驗共設3組：第一組為臍血中新分出的MNCs；第二組為共培養4d后，對照組（無滋養層），MSC組（MSC細胞滋養層），EPC組（EPC細胞滋養層）中的MNCs，第3組為共培養7d后，對照組（無滋養層），MSC組（MSC細胞滋養層），EPC組（EPC細胞滋養層）中的MNCs。共培養后的7組MNCs均以2×105／ml的密度接種于甲基纖維素半固體培養基中，每組3個復孔，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養箱中培養，7－10d后觀察集落生長情況，計數3組每個孔 CFU－E，BFU－E，CFU－GEMM，CFU－GM，CFU－G和CFU－M的總集落數，并進行比較。

1．2．6 統計學分析 多組計量資料的比較，采用方差分析的兩兩比較。

2 結果

2．1 共培養過程中，3組MNCs的擴增情況和擴增倍數的比較

圖1－1 共培養過程中3組MNCs的擴增情況

圖1－1結果所示，本組內部比較，對照組、MSC組、EPC組的擴增細胞數在第4天、第7天均較第0天呈增加趨勢。同時，第4天和第7天MSC組、EPC組的擴增細胞數均較對照組為多，且EPC組的細胞數增加更明顯。

圖1－2 共培養過程中三組MNCs擴增倍數的比較

圖1－2結果所示，共培養第4天，MSC組擴增細胞數約為對照組的1．71倍（＊＊，P＜0．01），EPC組擴增細胞數約為對照組的2．93倍（＊，P＜0．05），EPC組擴增細胞數約為 MSC組的1．57倍但差異無統計學意義。共培養第7天，MSC組擴增細胞數約為對照組的1．38倍（＊，P＜0．05），EPC組擴增細胞數約為對照組的2．10倍（＊＊，P＜0．01），EPC組擴增細胞數約為 MSC組的1．53倍（＊＊，P＜0．01）。共培養第4天與第0天比較，對照組擴增倍數約為2．025（＊＊，P＜0．01），MSC組擴增倍數約為3．775（＊＊，P＜0．01），EPC組擴增倍數約為5．925（＊，P＜0．05）；共培養第7天與第0天比較，對照組擴增倍數約為3．975（＊＊，P＜0．01），MSC 組擴增倍數約為 5．475（＊＊，P＜0．01），EPC 組擴增倍數約為 8．350（＊＊，P＜0．01）；共培養第7天與第4天比較，對照組擴增倍數約為1．96（＊＊，P＜0．01），MSC組擴增倍數約為1．45（＊，P＜0．05），EPC 組擴增倍數約為1．41（＊，P＜0．05）。

2．2 流式細胞術分析擴增前后CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例的變化

圖2－1結果所示，擴增前CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占MNCs的2．20%。

圖2－2結果所示，共培養7天后，對照組CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占 MNCs的1．40%；MSC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的1．85%；EPC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的0．41%。

圖2－3結果所示，共培養7天后，3組MNCs中CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例均較擴增前明顯下降。其中，MSC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs所占比例下降幅度沒有對照組顯著，而EPC組CD34＋CD45－的HSCs／HPCs所占比例較對照組下降更顯著。

2．3 共培養過程中，3組HSCs／HPCs集落形成能力的分析

圖2－1 擴增前HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

圖2－2 共培養7d后3組HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

圖2－3 共培養過程中HSCs／HPCs CD34表達的變化情況

圖3 共培養過程中3組HSCs／HPCs集落形成能力的分析

如圖3所示，共培養第4天和第7天，對照組和EPC組的HSCs／HPCs集落形成總數均較擴增前明顯下降，MSC組的HSCs／HPCs集落形成總數則呈增加趨勢。

共培養第4天的HSCs／HPCs，MSC組的集落形成總數為對照組的2．55倍（＊＊，P＜0．01），為EPC組的2．47倍（＊＊，P＜0．01）；共培養第7天的HSCs／HPCs，MSC組的集落形成總數為對照組的3．73倍（＊＊，P＜0．01），為EPC組的3．45倍（＊＊，P＜0．01）；共培養第4天與第7天的HSCs／HPCs，EPC組與對照組的集落形成總數均無顯著差異。

3 討論

本研究中，為形成與HSCs／HPCs體內生長相似的細胞微環境，我們并未將分離出的MNCs再次篩選獲得純度較高的CD34＋細胞進行實驗，而采用絲裂霉素C分別處理MSCs和EPCs以抑制其分裂增殖，制備滋養層細胞后，將新鮮臍血中分離的MNCs分別接種于2種滋養層細胞和僅有培養基的3種環境中進行接觸共培養，以7天為一個周期。通過對共培養體系的鏡下觀察和臺盼藍染色計數發現，3組MNCs數均隨時間變化而增加，以EPC組MNCs增加最顯著，MSC組次之。

為確定增加的MNCs中HSCs／HPCs的數量，我們從HSCs特征性表面抗原CD34的檢測和HSCs／HPCs特有的集落形成能力這兩個方面進行了探討。研究發現，MSCs可維持HSCs／HPCs表面抗原CD34的存在，且可從數量和集落大小兩個方面增強HSCs／HPCs的集落形成能力；而EPCs雖然使 MNCs總數顯著增加，但其中的CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例明顯下降，且在改變HSCs／HPCs的集落形成能力上無顯著作用。其中，MSCs對HSCs／HPCs的擴增作用可能與其分泌的多種細胞因子，以及多因子參與的信號通路有關［9］，如 Wnt［10］、Notch［6］；而 EPCs分泌的細胞因子及蛋白雖可增加細胞數量，但可能導致多潛能HSCs／HPCs選擇性擴增和終末分化，從而促進CD34＋細胞系特異性分化，并可能降低 HSCs／HPCs在骨髓內歸巢的能力［11］。因此，后續研究可分析MSCs與EPCs分泌的因子差異，從機制上探討影響HSCs／HPCs體外擴增的可能關鍵因素。同時由于MSCs一定條件下可衍生為EPCs，且EPCs可分泌細胞因子調節MSCs的活性，故后續研究也可嘗試將兩種細胞同時置于HSCs／HPCs體外擴增的微環境中，探討其共同作用及機制。

總之，本研究結果顯示，MSCs和EPCs均可促進 HSCs／HPCs的體外擴增，提供適合 HSCs／HPCs生長的微環境。MSCs可有效促進HSCs／HPCs的體外擴增，并保持其造血重建潛能和歸巢能力；而EPCs僅可增加擴增體系中的細胞總數，卻不能維持 HSCs／HPCs的造血潛能，可能與促進HSCs／HPCs向成熟造血細胞分化有關。

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