高肺血流幼豬模型中肺動脈血流動力學(xué)及組織學(xué)變化對血清基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

呂 民，施凱耀，張秀和

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心外科，吉林 長春130033）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）的致病機(jī)理至今尚未完全闡明，先天性心臟病伴肺動脈高壓的產(chǎn)生，預(yù)示著預(yù)后不良。近年來發(fā)現(xiàn)，體液因子在pH的發(fā)病中有重要作用。本實驗以高肺血流致肺動脈高壓幼豬模型，觀察其血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9）相應(yīng)變化，國內(nèi)罕有報道。為進(jìn)一步闡明肺動脈高壓的發(fā)生機(jī)理以及尋求新的治療方法提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料 雜種幼豬，年齡2－3月齡，體重7－10 kg，雌雄不拘，采用隨機(jī)數(shù)字表方法分2組：組①為高肺血流組（D－group，n＝12），全部行左側(cè)開胸，降主動脈與左肺動脈搭橋術(shù)較較差異無顯著性。術(shù)后所有動物正常飼養(yǎng)3個月，全部存活，體重增至12－17．5kg。主要儀器及試劑：多功能麻醉機(jī)（Blease英國）、血氣分析儀（i－STATI美國）、監(jiān)護(hù)儀（S／5麻醉監(jiān)護(hù)儀 芬蘭）、動脈測壓（BIOTRANS美國）、光學(xué)顯微鏡（日本）、豬血清基質(zhì)蛋白酶9（MMP9）試劑盒（美國）。其余實驗試劑及設(shè)備由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實驗室提供。

1．2 方法

實驗豬術(shù)前12h禁食。肌注氯胺酮20mg／kg，后建立腿部靜脈通路，靜脈注射戊巴比妥5mg／kg，插入氣管插管，連接麻醉機(jī)，行輔助呼吸。芬太尼20μg／kg、潘可羅寧0．1mg／kg靜脈注射維持麻醉，呼吸機(jī)控制呼吸。經(jīng)股動脈穿刺置管連接壓力換能器，術(shù)中監(jiān)測有創(chuàng)動脈血壓和心率，監(jiān)測血氣分析（pH 值、PaO2、PaCO2、血離子），鼻溫及肛溫監(jiān)測。組①行左側(cè)開胸，采用人工血管（直徑為1．0 cm）降主動脈與左肺動脈搭橋術(shù)。組②為對照組，麻醉、氣管插管呼吸機(jī)控制呼吸，只開胸?zé)o手術(shù)處理。全組術(shù)后90d分別進(jìn)行如上麻醉操作，仰臥位，固定四肢及頭部，然后正中開胸，檢測肺動脈收縮壓（PASP）、肺血管阻力，Elisa檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶。血清樣本提取：全血于室溫放置2h后于1000xg離心20分鐘，取上清，將標(biāo)本放于－20℃保存，為避免反復(fù)凍融，一次性檢測。

MMP－9試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中MMP－9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP－9抗原、生物素化的抗大鼠 MMP－9抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP－9呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

血流動力學(xué)測量及血清樣本提取完畢，實驗豬肝素化（3mg／kg）后，放血處死．完整取出心肺，行病理學(xué)檢測。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS11．5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)處理用組間t檢驗，百分率用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2．1 肺動脈收縮壓（PASP）、肺血管阻力（PVR）、Elisa檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶見表1、表2。

表1 肺動脈血流動力學(xué)變化

表2 血漿 MMP9濃度（μɡ／L）

2．2 形態(tài)學(xué)改變 HE染色顯微構(gòu)型改變：對照組：左肺肺小動脈壁薄腔大，內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則（圖1A）。高肺血流組：左肺肺小動脈中膜及內(nèi)膜增厚內(nèi)徑變小，且呈偏心性改變，其中部分血管床毀損（圖B）。高肺血流組右肺肺小動脈僅內(nèi)膜、中膜輕度增生，血管腔無明顯狹窄（圖1C）。

圖1 肺小動脈形態(tài)學(xué)改變（×100）

3 討論

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是在病理學(xué)上以肺動脈壓力異常升高和肺血管床進(jìn)行性閉塞為主要特征的一類疾病。其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理尚未完全闡明。

先天性心臟病合并肺動脈高壓，嚴(yán)重影響患者疾病預(yù)后，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。近年來，更接近于先心病病理生理條件的動物模型的建立，肺組織學(xué)和血液因子的研究取得進(jìn)展。

有報道稱，在ET－B受體缺陷的轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，出現(xiàn)肺動脈高壓，檢測到鼠肺內(nèi)MMP9明顯增高，由此提高VEGF的生物利用度、也提高細(xì)胞外基質(zhì)肌鈣蛋白的表達(dá)，參加肺血管重構(gòu)［1］。

MMP9是一種含鋅蛋白酶，能分解血管基質(zhì)的膠原組織，使平滑肌細(xì)胞移行至細(xì)胞外基質(zhì)［2］。MMP9正常情況下只少量存在，來源于成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，MMP9與MMPI在肺血管基質(zhì)的重構(gòu)、基底膜的形成及胎兒肺血管的形成起重要作用［3］。MMP－9的生理作用廣泛。MMP能分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物如ECM和基底膜，因此能參與呼吸道和肺的重建，它還能調(diào)節(jié)其他蛋白酶及細(xì)胞因子的活性，它能降解α抗胰蛋白酶，保護(hù)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性，能加強(qiáng)膠原質(zhì)膠體中膠原細(xì)胞和MMP－13的溶膠原活動，并且 MMP－9還能從白細(xì)胞介素8（CXCL8／CL8）上分解一個62氨基酸肽，使其向中性粒細(xì)胞的趨化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒細(xì)胞的趨化因子。此外，MMP－9結(jié)合CD44可釋放儲存的TGF－β1，另外，MMP－9可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以參與血管生成。VEGF能促進(jìn)受體flt－1磷酸化，提高血管平滑肌表達(dá) MMP1、MMP2、MMP9。MMPs的增高有利于血管平滑肌突破血管基質(zhì)進(jìn)而遷延［4］。

左向右分流型先天性心臟病伴隨肺動脈高壓的形成和發(fā)展，出現(xiàn)肺血管重構(gòu)。左向右分流型先心病血清存在 MMP－2、MMP－9的顯著增高，MMP－2、MMP－9可能協(xié)同參與肺血管重構(gòu)；PGE1可有效降低先心病血清 MMP－2、MMP－9和 TIMP－1，這可能是PGE1逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)的機(jī)制之一；介入封堵術(shù)和外科手術(shù)均可有效降低輕、中PH患兒血清MMP－2、MMP－9、TIMP－1 和 MMP－2／TIMP－1，其機(jī)制在于這兩手術(shù)都阻斷了先心病異常的血流動力學(xué)這一肺血管重構(gòu)的始動因子［5］。

本實驗表明，體肺動脈分流術(shù)后90d的檢測結(jié)果顯示左肺動脈主干擴(kuò)張，末梢狹窄，鏡下見肺小動脈內(nèi)膜和中膜平滑肌細(xì)胞過度增生，中膜及內(nèi)膜顯著增厚，其中部分血管腔完全閉塞，出現(xiàn)血管叢樣改變。右肺動脈壓力雖有升高，不及左肺動脈明顯，其肺小動脈中膜僅出現(xiàn)輕度增生，內(nèi)膜改變不明顯，血管壁無明顯增厚。

本實驗表明，高肺血流肺動脈高壓幼豬模型中，術(shù)后90天與基礎(chǔ)值相比，肺動脈收縮壓、肺血管阻力明顯升高，出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。血清基質(zhì)蛋白酶9明顯升高，出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異；而對照組上述指標(biāo)無明顯差異。可以證明，先天性心臟病肺動脈高壓時，肺血流動力學(xué)及組織學(xué)變化與血清基質(zhì)蛋白酶9變化呈正相關(guān)性。本實驗證明，實驗豬的心血管解剖及生理特點與人類極為相似。此動物模型的建立，為今后對人類先天性心臟病肺動脈高壓的形成機(jī)理及治療的深入研究提供了良好的實驗平臺。

［1］Ivy DD，McMurtry IF，Colvin K，et al．Development of Occlusive Neointimal Lesions in Distal Pulmonary Arteries of Endothelin B Receptor－Deficient Rats：A New Model of Severe Pulmonary Arterial Hypertension［J］．Circulation，2005，111（22）：2988．

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［4］Wang H，Metha JL，Chen K，et al．Human Urotensin II Modulates Collagen Synthesis and the Expression of MMP－1in Human Endothelial Cells［J］．J Cardiovasc Pharmacol，2004，44（5）：577．

［5］曾紅軍，龐玉生，梁秀安．小兒先天性心臟病并肺動脈高壓血清基質(zhì)金屬蛋白酶與其組織抑制物的變化［J］．中國實用兒科雜志，2008，23（10）：740．