不同照射劑量對肝癌細胞生長抑制率的影響

賈曉晶，于 雷，邱 玲，馬 巖，王方銳，陳玉丙

（吉林大學白求恩第二醫院 腫瘤放療科，吉林 長春130041）

肝癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤之一。未接受任何治療的肝癌患者平均生存期只有1～4個月。該疾病發生隱匿、病情發展迅速、肝內轉移及術后復發率高，加之早期診斷困難，就診時患者常為中晚期，手術難以切除，所以大部分肝癌病人往往依賴于非手術治療方法。常用的非手術治療方法包括肝動脈化療加栓塞（TACE）法、無水酒精注射法、射頻消融以及超聲聚焦治療（HIFU），但療效均不夠理想［1］。

放射治療作為腫瘤的主要治療方式之一已有上百年歷史。近年來立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy，SRT）應用于肝癌等惡性腫瘤的臨床治療并取得令人振奮的療效［2－4］。但目前SRT放療技術，主要是從物理學角度考慮精確定位和界定靶區，最大限度地將劑量集中到靶區，殺滅腫瘤細胞并盡可能降低靶區周圍正常組織的照射量，提高腫瘤控制率。事實上，借助于這種放射物理學優勢能否達到預期的目的，實現輻射生物效應優勢，關于這一點，目前尚缺乏有力的實驗室依據。本研究探討了不同劑量照射劑量對肝癌細胞殺傷效應的影響。將為SRT的臨床推廣和應用提供重要的放射生物學實驗依據，具有重要的理論意義和臨床應用價值。

1 材料與方法

1．1 細胞培養與試劑 SMMC7721肝癌細胞用添加10% 胎牛血清、100uits·mL－1青霉素及100μg·mL－1鏈霉素的（Life Technologies，Inc）DMEM培養基，置37℃，5%CO2的飽和濕度條件下孵育。DMEM培養基 （Invitrogen公司）；胎牛血清（Invitrogen公司）；培養至對數生長期，以5×105個細胞／孔，接種6孔板。

1．2 照射條件 采用國產X射線深部治療機進行照射，200kV，10mA，濾板0．5mmCu和1．0mm Al，源靶距50cm，吸收劑量率0．287Gy·min－1。細胞完全貼壁后，分為7組，分別給予0（假照組）、0．5、1、2、4、6、8Gy照射。

1．3 細胞克隆形成實驗 分別取各不同劑量照射組細胞各200個，接種于直徑60mm細胞培養皿，每組細胞接種3個培養皿，于CO2培養箱37℃培養7～10 d，1%甲基藍對所培養的細胞染色，統計細胞數大于50的克隆數。細胞存活分數（SF）按公式計算：

SF（%）＝ （NX／N0）×100%，

其中NX為細胞克隆數，N0為接種細胞數。

1．4 細胞凋亡檢測 將肝癌細胞SMMC7721以5×105個細胞／孔，接種6孔板，分7組，接種細胞24 h后分別接受0、0．5、1、2、4、6、8Gy X 線照射。照射后12h，收集細胞，給予AnnexinⅤ 和PI雙染、然后采用流式細胞術檢測不同輻射劑量對肝癌細胞早期凋亡的影響。

1．5 統計學分析 數據資料用SPSS 15．0軟件包（SPSS Inc，Chicago，IL）建立數據庫，并進行統計學分析。數據表示為均數±標準差。經方差齊性檢驗后，用單向方差分析對多組均值進行比較。P＜0．05為差異具有統計學意義的標準。

2 結果

2．1 不同輻射劑量對肝癌細胞生存率的影響

細胞克隆形成實驗結果表明，在不同劑量0、0．5、1、2、4、6和8Gy照射組中，細胞存活分數見表1。

表1 不同輻射劑量對肝癌細胞生存率的影響

2．2 細胞凋亡檢測 見表2。

表2 不同輻射劑量對肝癌細胞凋亡的影響

3 討論

放射治療作為腫瘤的主要治療方式之一，已有上百年歷史。據統計，目前約有2／3的惡性腫瘤病人在其病程的某一階段可接受根治性或姑息性放療。傳統放療方法由于受技術限制，不能把劑量都集中到靶區，靶區定位和界定精度較差，在給予腫瘤高劑量照射的同時也使旁鄰正常組織受到過量照射，易引起較嚴重的急性和遠期并發癥。這不僅限制了腫瘤治療的有效劑量，也明顯降低了患者的生活質量［5－7］。

近年來，隨著放療技術和設備的突飛猛進的發展，立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy－SRT）開始應用于肝癌等惡性腫瘤的臨床治療。SRT根據單次劑量的大小和射野集束的程度，可分為兩類：一類SRT的特點是使用小野三維集束分次大劑量照射（γ－刀、X－刀）；另一類SRT是利用立體定向技術進行常規分次的放射治療（三維適形放療、調強適形放療）。SRT定位、佰位精度高，可利用三維治療計劃系統，確定SRT的射線束方向，精確地計算并優化病變和鄰近重要組織器官的劑量分布。這樣多個小野三維集束定向照射，周圍正常組織受量很小，而射線對病變起到類似手術的作用。因此，SRT技術的應用即可嚴格保護鄰近重要器官，又可使病變靶區部位得到大劑量的照射［8，9］。

SRT治療肝癌即充分發揮了三維空間的聚焦優勢，通過共面或非共面等中心照射技術，采用多方位、多射束入射，使放射線集中至與腫瘤空間形態一致的靶區內，實現精確照射，從而減少靶區周圍正常組織的受照劑量，同時能避開靶區周圍重要器官，使靶區處方劑量的進一步提高成為可能。為提高腫瘤局部控制率，避免或減輕肝臟的放射性損傷提供了有力的技術保證。低分割單次大劑量照射同時也相應縮短了療程，為腫瘤的綜合治療贏得了寶貴的時間和機會。目前SRT在肝癌的放射治療中已經獲得了廣泛應用并取得了一定的療效，但目前SRT放療技術，主要是從物理學角度考慮精確定位和界定靶區，最大限度地將劑量集中到靶區，殺滅腫瘤細胞并盡可能降低靶區周圍正常組織的照射量，以提高TGF，提高腫瘤控制率。事實上，借助于這種放射物理學優勢能否達到預期的目的，從而實現輻射生物效應優勢，關于這一點，目前尚缺乏有力的實驗室依據。

本實驗探討了不同輻射劑量對肝癌細胞生存率和細胞凋亡的影響。實驗結果表明在不同劑量0、0．5、1、2、4、6和8Gy照射組中，細胞細胞存活分數隨著照射劑量的增加而減少。與0．5Gy和1Gy組相比，2、4、6、8Gy照射組的細胞存活分數明顯減低（P＜0．05）。而0．5Gy和1Gy照射組之間無顯著差異。2、4、6Gy組之間比較無顯著差異。而8Gy照射組的細胞存活分數明顯低于任何其他組（P＜0．05）。在0、0．5、1、4、6和8Gy照射組中，隨著照射劑量的增加細胞凋亡比率明顯增加。因此照射劑量是影響細胞生存率和導致腫瘤細胞凋亡的重要因素。因此，提高放療照射劑量可以明顯在體外影響肝癌細胞的存活，增加細胞凋亡。提高單次照射劑量，大分割照射模式能夠明顯提高腫瘤殺傷效應。因此，立體定向放療的單次大劑量分割照射模式是可以達到殺滅腫瘤細胞的臨床生物效應的，與常規2Gy等小劑量相比較，細胞殺傷效果更為顯著。本實驗通過比較SRT放療與常規放療模式輻射生物效應的差別，將為SRT的臨床推廣和應用提供重要的放射生物學實驗依據。

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