腫瘤壞死因子－α和血漿纖溶酶原激活抑制物－1與動(dòng)脈粥硬化相關(guān)性研究

林 紅

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 心內(nèi)二科，新疆 烏魯木齊830000）

動(dòng)脈粥樣硬化主要由于脂肪代謝紊亂和神經(jīng)血管失調(diào)所致，臨床上常伴發(fā)高血壓、高膽固醇血癥或糖尿病相關(guān)癥狀。該疾病多見(jiàn)于40歲以上男性和絕經(jīng)后的女性，并且隨著人們生活水平的提高和生活習(xí)慣不佳，易患人群已經(jīng)呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。因此，尋找一種快速有效的診斷方法對(duì)于該疾病的早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)顯得尤為重要。臨床上影像學(xué)診斷由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高以及特異性差等缺點(diǎn)而阻礙了動(dòng)脈粥樣硬化檢查的普及度。而關(guān)于細(xì)胞因子等危險(xiǎn)因子與動(dòng)脈粥樣硬化的研究有很多。例如總膽固醇、高密度脂蛋白、轉(zhuǎn)錄因子NF－κB、環(huán)氧合酶－2（COX－2）、C 反應(yīng)蛋白、集落刺激因子（CSFs）和TNF－α、PAI－1等均被證明與動(dòng)脈粥樣硬化具有相關(guān)性。本文旨在探究不同病灶類(lèi)型的動(dòng)脈粥樣硬化組織 TNF－α、PAI－1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，揭示組織TNF－α、PAI－1檢測(cè)用于動(dòng)脈粥樣硬化診斷和分型的臨床價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

納入研究的60例動(dòng)脈粥樣硬化患者均于2010年3月－2011年10月在我院接受動(dòng)脈粥樣硬化影像學(xué)檢查（X線檢查、動(dòng)脈造影和多普勒超聲波檢查），其中主動(dòng)脈粥樣樣硬化12例，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化12例，腦動(dòng)脈粥樣硬化12例，腎動(dòng)脈粥樣樣硬化12例，腸系膜動(dòng)脈粥樣樣硬化12例。按照病灶分型進(jìn)行分組：A組為I型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±6．5）歲；B組為Ⅱ型病灶，男6例，女4例，平均年齡（46．3±5．7）歲；C組為Ⅲ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（46．7±11．7）歲；D組為Ⅳ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±9．7）歲；E組為V型病灶，男6例，女4例，平均年齡（46．9±6．9）歲；F組為Ⅵ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±6．7）歲。

1．2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)X線檢查、動(dòng)脈造影和多普勒超聲波檢查所有患者均為不同類(lèi)型的動(dòng)脈粥樣硬化患者；②脂蛋白電泳圖形異常；③患動(dòng)脈粥樣硬化單一疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有動(dòng)脈粥樣硬化治療經(jīng)歷或動(dòng)脈粥樣硬化既往病例；②伴發(fā)其他心血管疾病例如腦血栓、冠心病等；③炎癥性動(dòng)脈疾病，例如多發(fā)性大動(dòng)脈炎、血栓性閉塞性脈管炎；④伴發(fā)有低熱、血沉增快等炎癥表現(xiàn)；⑤患有自身免疫性疾病、過(guò)敏反應(yīng)、炎癥疾病。

1．3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）

分別抽取所有患者脂肪組織，用博凌科為RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）抽提總mRNA。使用TAKARA公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增出總mRNA的cDNA。使用OD260對(duì)cDNA進(jìn)行定量。使用表1引物擴(kuò)增TNF－α、PAI－1和β－actin。50μl反應(yīng)體系中含有1 μl cDNA，8μl dNTPs，5μl 10×Buffer（Mg2＋），1μl LA Taq酶，35μlddH2O。然后設(shè)置PCR參數(shù)如下：95℃變性5min，30循環(huán)中95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延長(zhǎng)0．5min，最終72℃充分延長(zhǎng)10 min。

表1 引物表

1．4 蛋白印跡分析技術(shù)（Western Blot）

分別抽取所有患者脂肪組織，用5×Loading Buffer（TAKARA公司）混勻后在100℃孵育10 min。所有電泳樣品用15%SDS－PAGE電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%牛奶（PBST）封閉1h后，一抗稀釋液37℃孵育1h，膜經(jīng)清洗后繼續(xù)用二抗稀釋液37℃孵育1h。使用Amersham ECL（貨號(hào)：RPN2109）顯色，使用Bio－Rad凝膠成像儀進(jìn)行拍照和灰度分析。其中TNF－α一抗稀釋液是用10%牛奶按照1∶1000稀釋兔抗人TNF－α的抗體（Cell Signaling，貨號(hào)：3707S）；PAI－1一抗稀釋液是用10%牛奶按照1：1000稀釋兔抗人PAI－1的抗體（abcam，貨 號(hào) ab20562）；β－actin 一 抗 稀 釋 液 是 用10%牛奶按照1∶1000稀釋小鼠抗人β－actin的抗體（碧云天，貨號(hào)：AA128）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS12．0軟件計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用（x－±s）表示。計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用χ2和P值表示。P＜0．05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析TNF－α和PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2．1 動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

對(duì)動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化 脂 肪 組 織 中 TNF－α、PAI－1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行RT－PCR分析發(fā)現(xiàn)，隨著動(dòng)脈粥樣硬化病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加（P均＜0．05），說(shuō)明TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平與動(dòng)脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性。見(jiàn)圖1。圖1的瓊脂糖電泳圖為6組中選取1個(gè)病例組織的檢測(cè)結(jié)果。

2．2 動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)情況

對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織中TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行 Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，隨著動(dòng)脈粥樣硬化病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1表達(dá)水平均顯著增加（P均＞0．05），說(shuō)明脂肪組織TNF－α、PAI－1蛋白表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性，見(jiàn)圖2。曲線圖為6組TNF－α和PAI－1與內(nèi)參β－actin灰度比的平均值折線圖。

圖1 動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖2 動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)水平

2．3 動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α、PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量的相關(guān)性

對(duì)6組患者脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1mRNA 和蛋白表達(dá)量以顯著正相關(guān)性的關(guān)系顯著增加（r＝0．9488，P＜0．01；r＝0．9659，P＜0．01），說(shuō)明在動(dòng)脈粥樣硬化病情發(fā)展中，TNF－α、PAI－1mRNA 和蛋白表達(dá)量均會(huì)增加，且具有正相關(guān)性。

3 討論

動(dòng)脈粥樣樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管病中常見(jiàn)的一種疾病，該疾病從內(nèi)膜動(dòng)脈病變開(kāi)始，大量脂質(zhì)和復(fù)合糖類(lèi)沉積在內(nèi)膜上，導(dǎo)致血栓形成、纖維增生、鈣質(zhì)沉著、動(dòng)脈中層蛻變和鈣化，使動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)聚集而造成動(dòng)脈腔阻塞［1］。導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素包括先天因素和后天因素。先天因素主要是遺傳因素，例如LDL受體基因突變會(huì)導(dǎo)致低密度脂蛋白代謝受阻，從而引發(fā)血清中LDL水平升高，LDL的升高是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件，因此，LDL受體基因突變會(huì)誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化［2］。除了遺傳因素外，還有后天因素（吸煙、飲食、運(yùn)動(dòng)、感染、胎兒期環(huán)境、空氣污染等）參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。如吸煙會(huì)增加血清LDL水平，降低LDL水平［3］；肥胖造成的甘油三酯升高易引發(fā)動(dòng)脈粥樣樣硬化［4］；久坐的生活習(xí)慣與CAD危險(xiǎn)增加相關(guān)，而經(jīng)常鍛煉則具有保護(hù)作用。

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生會(huì)引發(fā)機(jī)體多種因子的異常，主要表現(xiàn)在血清甘油三酯超過(guò)1．81mmol／L、膽固醇超過(guò)6．76mmol／L時(shí)，高密度脂蛋白顯著升高、低密度脂蛋白（LDL）顯著升高、極低密度脂蛋白（VLDL）顯著升高和脂蛋白 A 顯著升高等［5－7］。除此之外，動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，大量數(shù)據(jù)均證明細(xì)胞因子參與動(dòng)脈粥樣硬化形成。如血管細(xì)胞粘附分子－1會(huì)誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)，且巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的組織因子也會(huì)參與凝血過(guò)程；各種炎癥因子會(huì)參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程，如 TNF－α、NO、IL－8、IL－6、IL－18和IL－17均參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，特別是IL－6被證明是與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜增厚具有密切聯(lián)系［8，9］。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明TNF－α不僅可以作為動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)測(cè)的危險(xiǎn)因子，還可作為動(dòng)脈粥樣硬化治療療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。林秋雄等［10］發(fā)現(xiàn)采用喂食高脂飼料誘導(dǎo)的兔模型血清TNF－α水平顯著高于正常家兔；許耘紅等［11］睡眠剝奪大鼠動(dòng)脈粥樣樣硬化進(jìn)展大鼠血清TNF－α顯著升高。基于上述研究結(jié)果，研究者已將TNF－α作為動(dòng)脈粥樣硬化藥物治療療效的評(píng)價(jià)方法。例如張志偉等［12］通過(guò)血清TNF－α水平探討瑞舒伐他汀治療動(dòng)脈粥樣樣硬化的療效，經(jīng)瑞舒伐他汀治療后的患者血清TNF－α水平顯著低于治療前，且通過(guò)血清TNF－α水平可區(qū)分瑞舒伐他汀和氟伐他汀治療效果。另外，血清TNF－α水平也可用于評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度，例如陳彩霞等［13］比較Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)斑塊血清TNF－α水平顯著高于Ⅰ級(jí)斑塊動(dòng)脈粥樣硬化，且得出血清CRP、TNF－α、IL－6水平增高與頸動(dòng)脈粥樣樣硬化斑塊嚴(yán)重程度密切相關(guān)的結(jié)論。邵鳳揚(yáng)等發(fā)現(xiàn)纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）的活性與血液纖溶系統(tǒng)密切相關(guān)，且與正組織型纖溶酶原激活物（tPA）的相互作用失衡會(huì)造成血栓或出血［14］；陳良華等在家兔模型中研究了卡托普利的藥物作用，治療后的兔模型血清纖溶酶原激活物抑制物－1表達(dá)量顯著低于治療前［15］。

基于上述的研究報(bào)道，我們通過(guò)RT－PCR和Western Blot檢測(cè)不同病灶類(lèi)型的動(dòng)脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α、血漿纖溶酶原激活物抑制劑－1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：脂肪組織 TNF－α、PAI－1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性，且TNF－α和PAI－1呈正相關(guān)性。由此可見(jiàn)，脂肪組織TNF－α、PAI－1檢測(cè)可能具有動(dòng)脈粥樣硬化病灶分型的診斷價(jià)值。

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