高效液相色譜法檢測多種動物組織中氟喹諾酮類藥物殘留量的研究

張玉潔，李 倩，汪 霞，王鶴佳，薛 毅，仲 鋒

(1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2．中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100026)

氟喹諾酮類藥物(FQs)自20世紀(jì)80年代初問世以來，相繼被合成了許多廣譜、高效、低毒的廣譜殺菌性抗菌藥，主要的藥物有諾氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達氟沙星等。它們的基本作用相似，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、支原體、某些厭氧菌均有效。本類藥物的毒副作用小，安全范圍較大。但本類藥物對動物骨骼生長發(fā)育有不良影響，禁用于幼齡動物和孕畜，同時對胃腸道、中樞神經(jīng)、肝細胞均有一定的危害［1］。隨著氟喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用以及耐藥性的產(chǎn)生，F(xiàn)Qs在可食性動物組織中的殘留問題已引起人們的高度關(guān)注。

農(nóng)業(yè)部第235號公告［2］對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達氟沙星及二氟沙星在多種動物組織中的最高殘留限量(MRL)進行了規(guī)定。而現(xiàn)在所用標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部第236號公告《動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法—高效液相色譜法》［3］和農(nóng)業(yè)部第1025號公告—14—2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》［4］在檢測藥物數(shù)量、動物品種及動物組織覆蓋面方面均滿足不了實際檢測的要求。同時，沙拉沙星在雞的肌肉組織中的最高殘留限量為10μg/kg，上述兩個標(biāo)準(zhǔn)的定量限也不能滿足限量要求。因此，本研究在以上兩個檢測方法的基礎(chǔ)上做進一步改進，增加了檢測藥物、動物品種及動物組織，降低了沙拉沙星定量限，以便更好地滿足實際檢測工作的需求。

1 材料與方法

1．1 儀器設(shè)備、試劑及對照品 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器);SPE柱:Bond Elut C18固相萃取柱(100 mg/1mL);固相萃取裝置;pH計;高速冷凍離心機;Milli－Q超純水儀。

環(huán)丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星對照品，純度≥99．0%，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;達氟沙星對照品，純度99．8%，由Sigma－Aldrich公司提供;沙拉沙星對照品，純度 95．0%，由Dr．Ehrenstorfer公司提供。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、氫氧化鈉、三乙胺、磷酸二氫鉀、檸檬酸、乙酸銨均為分析純。試驗用水為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的一級水。

1．2 溶液配制 5．0 mol/L氫氧化鈉溶液:取氫氧化鈉飽和液28 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。0．03 mol/L氫氧化鈉溶液:取5．0 mol/L氫氧化鈉液0．6 mL，加水稀釋至 100 mL，混勻。0．05 mol/L磷酸/三乙胺溶液:取濃磷酸3．4 mL，用水稀釋至1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至2．4。磷酸鹽緩沖溶液(用于肌肉、脂肪組織):取磷酸二氫鉀6．8 g，加水溶解并稀釋至500mL，用5．0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7．0。磷酸鹽溶液(用于肝臟、腎臟組織):取磷酸二氫鉀6．8 g，加水溶解并稀釋至500mL，混勻。洗脫液:取乙腈20 mL，用0．05mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL，混勻。

5種FQs標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別取達氟沙星對照品約10 mg，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星對照品各約50 mg，精密稱定于50 mL量瓶中，用0．03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為0．2 mg/mL(達氟沙星)和1 mg/mL(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星)的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。置2～8℃冰箱中保存，有效期為3個月。5種FQs標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋成達氟沙星(2μg/mL和0．2μg/mL)、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星(10μg/mL和1μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。置2～8℃冰箱中保存，有效期為1個月。

1．3 試驗方法

1．3．1 液相色譜條件 色譜柱:C18250 mm×4．6 mm(i．d)，粒徑 5 μm;流動相:0．05 mol/L磷酸/三乙胺溶液+乙腈(85+15，V/V)，使用前經(jīng)微孔濾膜過濾(測肌肉、脂肪、肝臟組織用);檸檬酸/乙酸銨溶液+乙腈(85+15，V/V)，使用前經(jīng)微孔濾膜過濾(測腎臟組織時用);流速:0．8 mL/min;檢測波長:激發(fā)波長280 nm;發(fā)射波長450 nm;柱溫30℃;進樣量40μL。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的測定 準(zhǔn)確量取適量FQs標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相稀釋成濃度分別為0．5、1、5、10、50、100 μg/L(以恩諾沙星為例)的對照溶液，供高效液相色譜分析。以各色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對照溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1．3．3 樣品前處理 取(2 ± 0．05)g試料，置50 mL離心管中，肌肉、脂肪試樣加磷酸鹽緩沖溶液10．0 mL，肝臟、腎臟試樣加磷酸鹽溶液 20．0 mL，渦旋混勻，中速振蕩 5 min。10000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中。肌肉、脂肪試樣殘渣中再加磷酸鹽緩沖溶液10．0 mL;肝臟、腎臟試樣殘渣中再加磷酸鹽溶液20．0 mL，重復(fù)提取一遍。合并兩次上清液，充分混勻，備用。

取腎臟試樣上清液10 mL于另一50 mL離心管中，加5 mL正己烷，中速振蕩5 min。5000 r/min離心5 min，取下層清液，混勻，備用。

固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL預(yù)洗。取備用液3．0 mL過柱，超純水1 mL淋洗，擠干。用洗脫液1．0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測定。

1．3．4 檢測限及定量限 分別取五種動物各自肌肉、脂肪、肝臟、腎臟4種組織的空白樣品進行添加回收實驗，按照上述樣品前處理方法處理，進HPLC分析。以S/N≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數(shù)均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)，以S/N=3作為藥物的檢測限(LOD)。

1．3．5 準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在5種動物的肌肉、脂肪空白組織中添加3個不同濃度(5μg/kg、100μg/kg和200μg/kg)(以恩諾沙星為例)的FQs標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收率測定，每個濃度設(shè)定5個平行樣品，同時進行空白試驗，重復(fù)3次，求每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。按照相同方法，在5種動物的肝臟、腎臟空白組織中添加3個不同濃度(10μg/kg、100 μg/kg和200μg/kg)(以恩諾沙星為例)的FQs標(biāo)準(zhǔn)溶液，求每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間RSD。

2 試驗結(jié)果

2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 達氟沙星在0．1～20 μg/L濃度范圍內(nèi)，其他4種FQs藥物在0．5～100 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其曲線方程和相關(guān)系數(shù)(R2)見表1所示。

表1 5種FQs藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2．2 檢測限及定量限 空白試料按1．3．3步驟處理后，測定結(jié)果表明:在相應(yīng)的保留時間處，大部分空白試料對所測分析物無干擾;少部分空白組織在藥物色譜峰保留時間處有較小干擾，可調(diào)整流動相比例避開干擾物質(zhì)或者在回收率計算中減去空白。圖1～圖3給出了標(biāo)準(zhǔn)對照液、牛腎臟空白樣品及組織添加樣品的色譜圖。

在豬、雞、牛、羊、兔的肌肉、脂肪組織中添加5種FQs藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在組織中的添加濃度分別為1、2．5 和 5 μg/kg(達氟沙星為 0．2、0．5和1μg/kg)。按照1．3．3提取凈化方法處理后，經(jīng)HPLC檢測。測定結(jié)果顯示，添加濃度為2．5μg/kg時，藥物的信噪比(S/N)約等于3，添加濃度為5μg/kg時，信噪比均大于10，為此，確定環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在豬、雞、牛、羊、兔的肌肉、脂肪組織中的檢測限為2．5μg/kg，定量限為5μg/kg;達氟沙星的檢測限為0．5μg/kg，定量限為1 μg/kg。

按與上述肌肉、脂肪組織相同的處理和分析，確定環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在豬、雞、牛、羊、兔的肝臟、腎臟組織中的檢測限為5μg/kg，定量限為10μg/kg;達氟沙星的檢測限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

2．3 準(zhǔn)確度和精密度 豬、雞、牛、羊、兔各四種組織中三個濃度FQs藥物添加回收試驗的回收率、批內(nèi)RSD和批間RSD結(jié)果見表2。

表2 5種FQs藥物準(zhǔn)確度及精密度試驗數(shù)據(jù)(n=5)

由表2數(shù)據(jù)可知，該方法在五種動物共20種組織中的平均回收率為62% ～103%;批內(nèi)變異系數(shù)為0．30% ～18%，批間變異系數(shù)為1．0% ～17%。方法準(zhǔn)確度、精密度良好。

3 討論

3．1 色譜條件的優(yōu)化 由于在測定腎臟組織時雜質(zhì)干擾較多，尤其是在牛的腎臟組織測定時，用原流動相 0．05 mol/L磷酸溶液/三乙胺 －乙腈(85∶15，V/V)，在被測物出峰時有較強的干擾，改變原流動相的比例也無法使其分離。因此在腎臟組織的提取過程中，增加了正己烷除脂的步驟，并用檸檬酸/乙酸銨溶液－乙腈(85∶15，V/V)作為流動相，試驗結(jié)果顯示(見圖1－3)，經(jīng)除脂和更換流動相后，在藥物色譜峰保留時間處基本不再有較強的雜質(zhì)峰干擾。最終確定在測定腎臟組織時，用檸檬酸/乙酸銨溶液 －乙腈(85∶15，V/V)作為流動相;在測定其它組織時，仍使用原流動相0．05mol/L磷酸溶液/三乙胺－乙腈(85∶15，V/V)。

3．2 提取條件的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部第236號公告《動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法—高效液相色譜法》［3］和農(nóng)業(yè)部第1025號公告—14—2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》［4］中對雞肌肉、脂肪、肝臟、腎臟四種組織均用10 mL提取液提取兩次，經(jīng)對更多的動物組織的試驗摸索，新方法對肝臟、腎臟組織采用了20 mL提取液提取兩次，不僅對殘留的藥物提取得更充分，同時降低了單位體積提取液中的雜質(zhì)量。

3．3 凈化條件的優(yōu)化 通過對200 mg/3 mL、500 mg/6 mL以及100 mg/1 mL等多種不同規(guī)格C18固相萃取柱的提取、凈化實驗，結(jié)果表明:規(guī)格大的C18固相萃取柱，雖然可過更多體積的提取液，進一步提高方法的靈敏度，但需要增加更多的有機溶劑和提取步驟，如氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等。而用原標(biāo)準(zhǔn)中的C18 100 mg/1 mL固相萃取柱，雖然方法靈敏度沒有用大規(guī)格C18固相萃取柱高，但也足以滿足235號公告中的限量要求。為此，該方法仍沿用吸附能力既能滿足限量檢測要求，同時又能充分洗脫的100 mg/1 mL C18固相萃取柱。

為了在滿足方法定量限要求的前提下進一步簡化操作步驟、減少雜質(zhì)干擾，該試驗取3．0 mL提取液過固相萃取柱。對比農(nóng)業(yè)部公告第236號《動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法—高效液相色譜法》中的“取適量備用液過柱”和農(nóng)業(yè)部1025號公告—14—2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》中“取5．0 mL備用液過柱”，取3．0 mL提取液過柱不僅滿足了定量限的要求，而且簡化了操作步驟，更重要的是減少了組織中的雜質(zhì)干擾，避免了固相萃取柱的堵塞，加快了凈化步驟，也縮短了整個樣品的前處理時間。

相對于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法，本方法提高了樣品提取時的離心速度，其目的是盡量減少懸浮于提取液中的組織雜質(zhì)，避免過固相萃取柱時造成柱子堵塞。這一改變在處理肝臟、腎臟時效果更加明顯。

相對于其他三種組織，經(jīng)磷酸鹽溶液提取并將兩次提取液合并后，腎臟組織的雜質(zhì)干擾更多，不僅過SPE柱的過程更為困難，并且在環(huán)丙沙星出峰的保留時間處有明顯干擾。因此，在20mL提取液合并后，取出10mL加入5mL正己烷除脂，振蕩、離心后取下層清液過SPE柱。經(jīng)此改進后，腎臟組織的前處理過程更為順利，HPLC分析結(jié)果也顯示雜質(zhì)干擾大大減少。

綜上所述，該方法操作簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度好，藥物和動物組織覆蓋范圍廣，可以很好地滿足實際檢測工作的需要。

［1］ 李俊鎖，邱月明，王 超．獸藥殘留分析［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2O02:257－262．

［2］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》［Z］．2002．

［3］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第236號《動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法—高效液相色譜法》［Z］．2003．

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告1025號—14—2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》［Z］．2008．