應激狀態對顳下頜關節內P物質影響的實驗研究

王曉菲

顳頜關節病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一種常見病和多發病，治愈率低，病因復雜，臨床表現為一系列顳頜關節及附近組織疼痛、張口受限等癥狀，嚴重影響患者的生存質量[1]。研究表明，SP廣泛分布于 TMJ（temporomandibuar joint）中，與TMJ病變的發生、發展密切相關[2]。與包括關節軟骨在內的各種骨代謝有密切的關系[3，4]。目前，TMJ內SP的相關應研究多為定性研究，缺乏明確的定量研究來觀察應激后TMJ內SP的變化。因此，本研究在建立應激動物模型，通過定量觀察應激前后TMJ內SP相關神經肽的變化，探討應激因素與TMD的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一級，60只，體重（150±10）g，雄性，由山東大學動物中心提供。

1.2 儀器與設備 隨機應激儀，自制，裝置分為兩部分即刺激儀和刺激籠。刺激儀在結構上由隨機發生器和輸出電路組成。隨機發生器由2個震蕩器形成隨機組合的脈沖，經延時后控制連續波發生器，后者產生4 Hz的連續頻率，它的持續時間即刺激時間可在2、5、10 s內選擇，隨機形成的連續波經輸出電路輸出，輸出脈沖的空載幅度為150 V。

1.3 實驗動物分組和方法 將60只大鼠分為空白對照組、電擊組（foot-shocked，FS）、應激組（emotional stress，ES）和藥物對照組（anti-anxiety-drug，AAD）15只/組。以上各組又隨機分為10、20、30 d三個亞組，5 只/組。

1.4 建模 模型建立時參考Rosales等[5，6]的模型。電擊組：每天固定時間給予電擊，30 min/d，電壓80 V，應激頻率4 Hz，以維持受刺激動物驚恐、緊張和憤怒的應激狀態。應激組：電擊組受電擊后排便，豎毛，尖叫等反應影響該組大鼠。藥物對照組：試驗前30 min給抗焦慮抑郁注射液注射量為1 mg/kg。空白對照組：不給予以上應激影響。各組大鼠的體重、性別通過均衡檢驗，證實無顯著性差異。各組大鼠均為普通固體飼料，自由飲水，同等飼養。實驗開始前1周，將大鼠放入交流箱中適應一段時間，不給予應激。應激時間設置為10 d組、20 d組和30 d組。其中電擊組大鼠僅作為應激源，不參與實驗測試。藥物對照組與應激組大鼠一樣，同期、同樣的條件下開始實驗，但藥物對照組大鼠在實驗前30 min皮下注射抗焦慮抑郁藥。每天上午的固定時間給予應激，以嚴格對照，保證研究結論的可靠性。

1.5 RT-PCR 取大鼠髁突，將髁突液氮處理并研磨。常規方法提取收集TMJ髁突軟骨組織的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），采用反轉錄脫氧核糖核（Complementary deoxyrlibonucleic acid，cDNA）合成試劑盒合成cDNA，設計引物序列進行RT-PCR擴增，β-actin用做內定參考。

引物設計如下：SP （252bp） 上游：5’-GAG CCCTT TGA GCAT CTTCT-3’； 下 游 ：5’-ACG CCTTCTTTCGTAGTTCTG-3’。β-actin （422bp）上游：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；下游：5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3’。

PCR 擴增：PCR 反應總體積 25 μl， 包括：PCR Mix 10 μl， 上、 下游引物共 1 μl，cDNA 模板 2 μl，H2O 12 μl。 PCR 條件為 95℃預變性 5 min，94℃變性 1 min，58℃和 56℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35個循環后，最后一個循環72℃ 10 min。

取 SP 及 β-actin，擴增產物各 5 μl，混合后 2%瓊脂糖凝膠電泳1 h。RT-PCR電泳結果經凝膠成像系統的分析軟件進行量化處理，用β-actin作內參照，對SP基因表達的相對量進行分析。用SPSS15.0軟件單因素方差分析對實驗數據進行處理。

2 結 果

2.1 大體觀察 實驗中，FS組大鼠有跳躍，翹尾，豎毛等行為表現，ES組大鼠有豎毛、恐慌等應激行為表現。藥物對照組沒有豎毛、恐慌等應激表現。各組取材時，同性別大鼠平均體重相似。各組大鼠無意外死亡。

2.2 SPRT-PCR結果 以β-actin擴增產物作為內參照進行半定量分析：ES組SPmRNA的表達量最高，AAD組和對照組SPmRNA的表達量較低。統計結果顯示，ES組、AAD組和對照組均有顯著差異（P<0.05），AAD 組與對照組無顯著性差異（P>0.05）。

10 d時，ES組SP表達最高。AAD組神經肽分子的表達略有升高，各組比較均有統計學差異（P<0.05）。20 d時，ES組相比10 d時顯著降低 （P<0.05），高于對照組與AAD組；AAD組相比10 d水平顯著降低 （P<0.05），與對照組無顯著差異 （P>0.05）。30 d時ES組和AAD組SP的表達水平顯著低于10 d與20 d（P<0.05），與對照水平無顯著差異（P>0.05）。

圖1 SPRT-PCR檢測結果圖

3 討 論

TMD指發生在TMJ 區及相應的軟組織的一類以肌肉的疼痛、異常關節音及下頜運動異常和伴有功能障礙為主要特征的一組疾病的總稱，其在人群中的發病為20%～40%，是口腔醫學臨床最常見的疾病之一[7]。該病的病因比較復雜，對其病因和發病機理的研究表明，TMD是多種因素作用的結果，尤其與患者的情緒抑郁、環境壓力有著密切的關系，應激因素對該病的發生、發展及預后有著重要的影響[8，9]。

20世紀50年代Schwartz等[10]報道了TMD與心理因素有關，此后關于應激對口頜系統健康的影響乃至其在口頜肌功能紊亂、TMJ疼痛的發生、發展和治療效果方面的研究時有報道[10-13]，但迄今仍沒有確鑿的證據證明兩者之間存在直接因果關系。本研究參考了Rosales等[5，6]的應激模型，并在此基礎上證實了應激對TMJ具有一定的影響。

SP具有促進肥大細胞脫落，釋放組胺及5羥色胺等各種傷害性刺激因子，誘導滑膜細胞中DNA和蛋白質的合成與分裂作用[14]。能與已知的滑膜細胞的另兩種刺激因子白細胞介素-1和腫瘤壞死因子有相互作用，共同發揮對滑膜細胞的作用。如壓力、精神緊張和炎癥介質等，都能激活傷害感受器引起SP合成和釋放增加。本文結果提示在應激因素引起的TMJ病變過程中的初期，SP合成和釋放增加，會對表面滑膜細胞產生作用，致使表層膠原纖維的破壞；隨著應激時間的延長，動物對應激的慢慢適應，SP合成和釋放減少，癥狀可能會有所減輕。

本文結果說明應激對TMJ的影響可能是體內多種相關神經肽分子變化的作用。可為預防和治療與應激相關的TMD提供理論依據?？蔀檫M一步闡明心理因素與TMD的關系提供了理論依據，對臨床雙軸診斷和治療具有一定的理論指導義意。

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