利用LC/MS/MS方法檢測(cè)人參蘆頭中人參皂苷Rg1和Re的含量*

吳睿凡，趙松巖，劉運(yùn)嘉，吳曉霞，彭 娟，閆 寒，聶穎蘭，郭 娜 ，范 斌△

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830011;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 110016;3.沈陽(yáng)市藥品不良反應(yīng)和醫(yī)療器械不良事件監(jiān)測(cè)中心，沈陽(yáng) 110013;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

人參為五加科植物，人參 Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根莖，性甘微苦、微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智之功效。臨床多用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、氣血虧虛、久病虛贏等病證的治療［1］。人參中的人參皂苷為重要的活性成分，現(xiàn)代對(duì)人參皂苷的含量測(cè)定有許多方法，主要采用高效液相色譜法、高效液相色譜 －蒸發(fā)光散射檢測(cè)等［2～5］，但人參皂苷 Rg1和 Re較難完全分離。其次，目前對(duì)于人參蘆頭成分含量的研究較少。本文建立的檢測(cè)人參蘆頭中人參皂苷Rg1和Re含量的LC/MS/MS方法，在2 min內(nèi)2種皂苷全部出峰，方法快速靈敏。

1 材料

1.1 藥物及試劑

Re、Rg1均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，人參產(chǎn)地吉林(批號(hào)0090410)，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮主任醫(yī)師鑒定為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。正丁醇(分析純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)均購(gòu)于北京迪科馬科技有限公司。

1.2 儀器

Agilent 6410 QQQLC-MS分析系統(tǒng)(美國(guó)Agilent RRLC液相色譜儀;Agilent 6410 QQQ三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器;Masshunter工作站)，賽多利斯arium61316/611VF超純水處理器、賽多利斯 BT25S分析天平和多功能提取罐。

2 人參蘆頭中人參皂苷Rg1和Re的測(cè)定方法學(xué)考察及含量測(cè)定

2.1 色譜條件

液相條件:Agilent ZORBAX C18 SB(2.1×50mm 1.8-Micron);流動(dòng)相:A:水(0.05%FA)，B:乙腈;A∶B=70∶30(V/V)，梯度洗脫:0min～2 min，B:60%;2min～3 min，B:100%，流速為 0.35 mL·min－1;柱溫:40 ℃ 。

質(zhì)譜條件:正離子模式，MRM，Re m/z 969.6→789.5，Rg1m/z 823.5→643.5。利用以上色譜條件分析得到 Re和 Rg1的混合對(duì)照品的總離子流圖(TIC)(圖1)和各自的提取離子流圖(EIC)(圖2)及各成分在人參蘆頭中的TIC圖(圖3)。

2.2 供試品溶液的制備

圖1 人參Re和Rg1對(duì)照品的TIC和EIC圖

圖2 人參蘆頭樣品中Re和Rg1的TIC和EIC圖

取本品粉末0.1 g過(guò)40目篩精密稱定，精密加入水飽和的正丁醇5ml密塞，放置過(guò)夜，超聲(功率250W，頻率50kHz)處理30min，2次合并濾液，精密量取濾液0.5ml，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)蛹状?ml超聲溶解，0.22um微孔濾膜，即得。

2.3 線性關(guān)系

精密稱取Re和Rg1對(duì)照品，Re的濃度依次為1.5、3.0、6.0、12.0、24、48ng/mL;Rg1的濃度分別為3.5、7.0、14、28、56、112ng/mL，按 2.1 的色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積Y對(duì)濃度X進(jìn)行回歸處理得到Re和Rg1的回歸方程分別為 Y=55.2216X－50.6413(r=0.9996)和Y=91.3617X+17.8616(r=0.9992)，說(shuō)明 Re和 Rg1分別在1.5～48 ng/mL和3.5～112 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度

按2.3制得的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組分的峰面積，計(jì)算6次的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，得到人參皂苷Re和人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為4.1%和3.9%。

2.5 方法的重復(fù)性

按2.2平行制備6份樣品，按2.1的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄人參皂苷Re和人參皂苷Rg1的峰面積，計(jì)算6份平行樣品間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.9%和4.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率

取上述已測(cè)知含量的樣品粉末6分，各約0.1 g精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)制備樣品，2.1項(xiàng)的液質(zhì)條件進(jìn)樣分析。計(jì)算加樣回收率，公式為加樣回收率 =(加樣后測(cè)定值 －原樣測(cè)定值)/加樣量 ×100%，并求得標(biāo)準(zhǔn)偏差。求得回收率平均值(n=6)分別為95.8%、96.7%，RSD分別為4.9%和4.2%。

2.7 樣品穩(wěn)定性

將制備好的供試品溶液于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，考察表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 含量測(cè)定

按2.2項(xiàng)下制備樣品，測(cè)得人參蘆頭中人參皂苷Re和人參皂苷Rg1的含量分別為0.68 mg/g和0.70 mg/g。

3 討論

本方法利用LC-MS/MS方法對(duì)人參蘆頭中人參皂苷Re和人參皂苷Rg1進(jìn)行了含量測(cè)定，比傳統(tǒng)方法快速、準(zhǔn)確且靈敏。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典一部.［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:8.

［2］徐暉，曾元兒.薄層掃描法測(cè)定人參及其制劑中人參皂苷Rg1的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，1998，9(2):106-107.

［3］潘堅(jiān)揚(yáng)，程翼宇，王毅，等.9種人參皂苷同時(shí)測(cè)定方法及在人參質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用［J］.分析化學(xué)，2005，33(11):1565-1568.

［4］徐靜，賈力，趙余慶.人參的化學(xué)成分與人參產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2011，34(03)199-203.

［5］常建濤，富瑤瑤，吳迪，等.敦化人參各部位皂苷組分的比較［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(1):43-45.