H2S、NO在腸缺血-再灌注損傷大鼠血漿中的表達

黃驚鴻，盧根林，鄧 勇

(1.義烏市中心醫院，浙江 義烏 322000；2.青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001)

·基礎與臨床研究·

H2S、NO在腸缺血-再灌注損傷大鼠血漿中的表達

黃驚鴻1，盧根林1，鄧 勇2

(1.義烏市中心醫院，浙江 義烏 322000；2.青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001)

目的： 研究H2S、NO在大鼠腸缺血-再灌注損傷血漿中的表達。方法雄性Wistar大鼠24只，分為S(假手術)組、I(缺血-再灌注)組,N(缺血-再灌注+ NaHS)組，每組8只。N組在再灌注前10min靜脈注射100μmol/kgNaHS后按1mg.kg-1.h-1持續靜脈注射直到再灌注2h，S和I組靜脈注射相同體積的生理鹽水。留取血測定H2S、NO,電鏡下觀察回腸組織病理變化，RT-PCR檢測回腸組織iNOSmRNA的表達,分光光度法測定回腸組織iNOS酶活性。結果N組H2S、NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性分別為(35.27±3.14)μmol/l、(70.30± 6.32)μmol/l、(0.511±0.029)、(1.724±0.087)U/mg protein,低于S組、高于I組(P<0.01)。H2S與NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性呈負相關(r=-0.771、-0.876、-0.831,P<0.01)。結論H2S下調iNOS基因的表達，減少NO合成和釋放，對大鼠腸缺血再灌注損傷起保護作用。

缺血-再灌注損傷；回腸；硫化氫；一氧化氮

Abstract：[Objective] To investigate the expression of hydrogen sulfide and nitric oxide in the serum of rats with ischemia-reperfusion injury. [Method] Wistar rats were randomly divided into three groups (8 in each group): S (sham), I (ischemia-reperfusion), N (ischemia- reperfusion and sodium hydrosulfide). Rats in Group N were received sodium hydrosulfide (100μmol/kg bolus +1mg.kg-1.h-1 infusion) 10min prior to the onset of reperfusion, whereas rats in group S and I were received normal sodium of equal volume. Blood was used to detect hydrogen sulfide and nitric oxide. The iNOS activiy in small intestine were measured by spectrophotometry. Ileum morphology was studied by transmission electron microscope. Expression of iNOS mRNA was determined by RT-PCR. [Result] H2S, NO, iNOSmRNA and iNOS activity in group N was (35.27± 3.14)μmol/l, (70.30±6.32)μmol/l, (0.511±0.029), (1.724±0.087)U/mg protein respectively which was notably higher than that in group I, strikingly lower than that in group S (p<0.01). H2S negatively correlated with NO, iNOSmRNA, iNOS activity (r= -0.771, -0.876, -0.831, p<0.01). [Conclusion] H2S plays an important role in protecting ischemia-reperfusion injury of small intestine in rats by down-regulating iNOS gene and reducing NO production.

Keywords：ischemia-reperfusion injury; small intestine; hydrogen sulfide; nitric oxide

小腸缺血再灌注(Ischemia—Reperfusi0n，I/R)損傷可在壞死性小腸結腸炎、腸梗阻、腸扭轉、腸系膜上動脈栓塞等多種急腹癥中發生，亦是影響腸移植成敗的重要病理過程。H2S是繼NO和CO之后的第三氣體信號分子，由胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-splitting enzyme, CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)催化L-半胱氨酸代謝產生[1-3]。NO是一種炎癥因子[4-5]。H2S、NO在腸缺血-再灌注損傷大鼠血漿中的表達及其意義，國內外文獻鮮見報道，現加以探討。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠(西安交通大學醫學院動物中心提供，清潔級)；敏感硫電極和PXS-270離子計購于上海雷磁儀器廠， iNOS酶活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所， RT-PCR Kit 購于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產品，iNOS引物上游引物: 5’-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3’下游引物: 5’-CTCCTGCCCGC TGAGTTCGTC - 3 ’，擴增片段為514bp；β-actin上游引物: 5’-GAGGCCCAGAGCAAGAG AGG-3’,下游引物: 5’-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3’,擴增片段為302bp,由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組 雄性Wistar大鼠24只，6周齡，體重(210±15)g，隨機分為S (假手術)組、I(缺血-再灌注)組,N(缺血-再灌注+ NaHS)組，每組8只。N組在灌注前10min時靜脈注射100μmol.kgNaHS后按1mg.kg-1.h-1輸注直到再灌注2h，S和I組靜脈注射相同體積的生理鹽水，作用時間和持續時間均同N組[1-2]。S組僅行剖腹及游離腸系膜上動脈(SMA)，I 和N組剖腹、游離及鉗夾腸系膜上動脈60min和再灌注120min，建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型。再灌注2h處死I 、N和S組大鼠，取血離心分離血漿，立即切取距回盲瓣 30cm 的回腸5cm，其中5cm 回腸DEPC水清洗腸內容物后置于冷凍管中，液氮中保存。

1.2.2 血漿H2S、NO的檢測 敏感硫電極法[6]測定血漿H2S濃度，化學法測定血漿NO含量。

1.2.3 回腸組織病理學改變 透射電鏡下觀察線粒體變化，取1mm×1mm×1mm回腸組織，采用戊二醛-餓酸雙重固定，超薄切片，醋酸鈾染色，電鏡下觀察、拍片。

1.2.4 RT-PCR檢測回腸組織iNOSmRNA的表達 Trizol一步法提取回腸黏膜總RNA，電泳見28s、18s條帶，以2.5μg總RNA為模板，以Random Premier為引物進行逆轉錄反應合成cDNA。iNOS PCR的反應條件為：95℃預變性3min后，95℃ 變性10s、55℃退火10s、72℃延伸20s,40個循環，72℃ 延伸7min；取PCR產物10μl，用凝膠圖像分析系統拍攝并分析結果。

1.2.5 回腸組織iNOS活性的測定 根據 iNOS試劑盒說明書制備10%回腸組織勻漿，考馬斯亮蘭法測定組織蛋白含量，然后測定組織 iNOS活性，采用721分光光度計在530 nm波長、1cm光徑下測各管吸光度值(0D)，根據OD值計算iNOS活性(U/mg protein)。

2 結果

2.1 大鼠回腸病理改變

圖1-2示：I組大鼠回腸粘膜腺上皮細胞線粒體水腫，嵴變短、減少；S組大鼠回腸粘膜腺上皮水腫程度較輕，線粒體改變明顯好轉。表明H2S對大鼠腸缺血再灌注損傷起保護作用。

圖1 示I組透射電鏡下回腸粘膜腺上皮細胞線粒體改變

圖2 示S組透射電鏡下回腸粘膜腺上皮細胞線粒體改變，(TEM×6000)

圖3 示大鼠回腸組織中iNOSmRNA的表達M：DNA Marker；1： S組；2：I組；3：N組

2.2 大鼠血漿NO、H2S及回腸組織iNOSmRNA、iNOS酶活性的變化

表1及圖3示：N組H2S、NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性顯著低于S組、高于I組(P<0.01)，H2S與NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性呈負相關(r=-0.771、-0.876、-0.831,P<0.01)。

組別iNOSmRNAFiNOS酶活性(U/mgprotein)FNO(μmol/L)FH2S(μmol/L)FS0.284±0.0370.972±0.04948.43±7.6342.57±7.18I0.612±0.035*2.344±0.117*119.19±9.93*24.38±2.69*N0.511±0.029*△7.241.724±0.087*△8.6770.30±6.32*△11.235.27±3.14*△9.12

注：與S比較,*P<0.01;與I比較,△P<0.01

3 討論

H2S是繼NO和CO之后的第三個被確定的氣體信號分子，由CSE和CBS催化L_半胱氨酸代謝產生[1-3]。本研究發現：S組血漿H2S為(42.57±7.18)μmol/L與Sodha NR報道的相一醫院致[3]。腸黏膜對缺血缺氧尤為敏感，表現為廣泛功能障礙、黏膜屏障的通透性增高、腸道細菌的移位、毒素吸收及遠處器官的損傷，出現嚴重的臨床癥狀和并發癥，是反映小腸缺血再灌注損傷較直觀的指標。本研究發現，I組大鼠回腸粘膜腺上皮細胞線粒體水腫，嵴變短、減少；S組大鼠回腸粘膜腺上皮水腫程度較輕，線粒體改變明顯好轉，表明H2S對大鼠腸缺血再灌注損傷起保護作用。

一氧化氮合酶存在于內皮細胞、巨噬細胞、神經吞噬細胞及神經細胞中，有3種亞型：在正常狀態下表達的神經元型一氧化氮合酶(nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在損傷后誘導表達的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。NO是一種炎癥因子[4-5]。內源性NO可通過降低血管反應性、維持小腸的血液灌注、抗血小板和白細胞聚集，清除氧自由基、抑制脂質過氧化和改善微循環等多個環節發揮對小腸缺血-再灌注損傷的保護作用[7]。NO的過量生成將會損傷組織細胞：NO參與中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的毒性作用同時與O2結合生成過氧亞硝酸基，過氧亞硝酸基可直接或通過分解成許多小分子毒性物質損傷細胞，NO通過這些毒性作用可直接損傷細胞的DNA或作用細胞的凋亡信號通路或協同其他細胞因子誘導細胞凋亡，同時在凋亡細胞中，一氧化氮合酶mRNA表達明顯增強，說明NO能夠誘導凋亡[7]。本研究發現：腸缺血-再灌注損傷大鼠中iNOS基因上調，NO大量生成。H2S下調iNOS基因的表達，減少NO合成和釋放，與Oh[8]研究結果相一致，對腸缺血-再灌注損傷起保護作用。

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The expression of hydrogen sulfide and nitric oxide in the serum of rats with ischemia-reperfusion injury

HUANG Jinghong1, LU Genlin1, DENG Yong2

(1. Yiwu Central Hospital, Zhejiang 322000, China；2. Qinghai University Affiliated Hospital, Qinghai 810001, China)

R656.7

A

1672-0024(2012)02-0040-03

黃驚鴻(1969-)，男，浙江義烏人，本科，副主任醫師。研究方向：普通外科學