復方苯乙哌啶對大鼠腸傳輸功能、病理和神經遞質的遠期影響

包云光，李小兵，趙 嬋

(金華市中心醫院，浙江 金華 321000)

·基礎與臨床研究·

復方苯乙哌啶對大鼠腸傳輸功能、病理和神經遞質的遠期影響

包云光，李小兵，趙 嬋

(金華市中心醫院，浙江 金華 321000)

目的： 通過建立大鼠便秘模型，探討復方苯乙哌啶對大鼠腸傳輸功能、病理組織學和神經遞質的遠期影響及其安全性。方法給健康Wistar大鼠飼喂含復方苯乙哌啶的混懸液為實驗組，飼喂普通水作為對照。飼養90天后停藥1周，測定腸道傳輸功能；觀察結腸大體形態和病理組織學檢查；測定結腸黏膜NO、SP含量及VIP陽性細胞分布情況。結果實驗組大鼠日均糞便粒數小于對照組(P<0.001)；實驗組大鼠首粒黑便排出時間慢于對照組 (P<0.05)。造模第5天、第90天2組間平均體重差異無統計學意義。2組大鼠結腸黏膜光鏡下病理組織學表現類似。結腸黏膜NO、SP含量、VIP陽性細胞分布2組間差異無統計學意義。結論復方苯乙哌啶較長期使用可致腸道傳輸速度明顯減慢，造成頑固便秘, 但對腸黏膜組織病理及腸神經系統遞質NO、 SP、VIP的產生均無明顯遠期影響。

復方苯乙哌啶；傳輸功能；病理；神經遞質；遠期影響

Abstract: [Objective] This study was designed to evaluate long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transport function, colonic histopathology and the neurotransmitter, and provide a basis for further evaluation of the safety of its clinical application. [Method] Healthy Wister rats were divided randomly into control group and constipation group. In constipation group, the rats were daily administered diphenoxylate to develop slow transit constipated model, while the control rats taken without any drugs. The fecal number, fecal weight and body weight of rats were recorded. Transit functions of intestinal movement were examined. The levels of NO, SP were measured, and the distribution of VIP positive cells was observed. [Result]The fecal number daily in the constipated group was decreased significantly than that in controls (P<0.001). The time of discharge of the first black faeces ，significantly longer than that in controls (P<0.05). The average body weight on the first five days, the 90 days between the two groups had no significant difference. No obvious differences of colonic histopathologic manifestations were observed between the two groups. The differences of NO, SP levels and density of VIP positive cells in distal colonic segment between the two groups had not reached significance. [Conclusion]Diphenoxylate can slow intestinal transit function after longer-term administration, resulting in intractable constipation, but had no histopathological damage on the colonic mucosa，and had no significant long-term effects on the enteric nervous system of NO, SP, and VIP neurotransmitter production.

Keywords: diphenoxylate; intestinal transit function; pathology; neurotransmitters; long-term effects

復方苯乙哌啶(Diphenoxylate)為鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品復合制劑，主要作用于U型阿片受體，對中樞神經系統產生鎮靜、鎮痛作用，降低內臟的敏感性，提高胃腸平滑肌的張力，其止瀉、緩解腹痛效果明顯，見效快，被臨床尤其基層廣泛應用。長期服用可成癮,大劑量可致欣快感，過量可致嚴重的呼吸抑制和昏迷[1]。本研究通過建立大鼠模型，觀察體重、大便、病理組織學的變化，測定腸道傳輸功能和結腸黏膜NO、SP含量，及VIP的分布情況，以了解復方苯乙哌啶較長期使用對腸道傳輸功能、病理組織學和神經遞質、以及機體的遠期影響，為進一步評價其臨床應用的安全性提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

32只健康Wistar大鼠，雄性，6～8周齡，體重110～130g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號SCXK(滬)2007-0005，隨機分為對照組16只和實驗組16只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型建立 大鼠模型建立參照劉海峰的方法[3]。大鼠分籠飼養，保持適宜環境，飼以普通級顆粒飼料。3天后開始建立模型，給實驗組Wistar大鼠飼喂含復方苯乙哌啶(常州康普藥業有限公司生產)混懸液，劑量8mg/kg·d，對照組飼喂自來水。每5日記錄一次大鼠大便粒數、干重及大鼠體重。飼養90天。

1.2.2 腸道傳輸功能測定 采用活性炭灌胃法測定首粒黑便排出時間。停藥1周的大鼠禁食24 小時，經口灌入100g/L活性炭懸液2ml。從活性炭灌胃完畢開始計時，記錄從灌胃到首粒黑便排出時間。

1.2.3 結腸黏膜NO及SP測定 大鼠經2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，通過腹正中切口，切取遠段結腸，縱向剪開，在預冷的生理鹽水中清洗。經液氮研磨制成10%(質量體積比)勻漿低溫離心，留取上清液，-70℃保存待測。NO測定采用硝酸還原酶法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。SP用雙抗體夾心ELISA法檢測，試劑盒購自Rapid Bio Lab。

1.2.4 HE染色和免疫組化染色 剪取大鼠結腸遠段約1cm，縱行剖開，生理鹽水漂洗后，固定于10%甲醛溶液，常規脫水、石蠟包埋切片，分別進行HE染色和免疫組化染色。免疫組化試劑盒購自DAKO公司。VIP為武漢博士德生物技術有限公司產品BA-0134； PBS代替一抗為空白對照；結果：陽性為黃色或黃棕色，細胞核呈藍色。

1.2.5 VIP計分標準 (1)陽性染色細胞數占視野細胞總數的多少計分為A：沒有陽性染色細胞記為-；陽性細胞百分數<25%為+；25～50%為++；>50%為+++；(2)按著色細胞染色強度計分為B：細胞呈陰性染色為-；染色弱，陽性細胞呈淡黃色為+；染色中等，陽性細胞呈棕黃色為++；染色強，陽性細胞呈棕褐色為+++。A和B相加作為判斷結果，再做分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS11.0統計軟件包進行統計學處理。采用t檢驗和秩和檢驗。P<0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠糞便粒數、每日糞便質量及大鼠體重變化

實驗組大鼠日均糞便粒數小于對照組，差異有統計學意義，見表1。而日均糞便干重在2組間的差異無統計學意義。造模第5天2組間的平均體重和造模第90天2組間的平均體重差異無統計學意義。實驗組大鼠腸道傳輸速度與對照組相比明顯減慢，首粒黑便排出時間延長，分別為(430.2±132.1)min和(337.2±74.7)min，差異有統計學意義(t=-2.450，P<0.05)。

表1 造模大鼠糞便粒數、干重及體重變化

2.2 大鼠結腸大體形態觀察和病理組織學檢查

實驗組結腸較對照組粗大、迂曲。結腸黏膜HE染色顯示上皮細胞核呈藍色，胞漿為淡紅色。部分有少量炎癥細胞浸潤、淋巴細胞聚集等，偶有上皮細胞脫落，未見明顯潰瘍，2組大鼠結腸黏膜光鏡下病理組織學表現相類似。

2.3 結腸遠段黏膜神經遞質含量變化

遠端結腸黏膜NO含量和SP水平在2組間差異無統計學意義，見表2。遠端結腸黏膜VIP陽性細胞分布在2組間差異也無統計學意義，見表3。

表2 造模大鼠遠段結腸黏膜NO及SP的變化

表3造模大鼠遠段結腸黏膜VIP計分結果[累加例數(%)]

VIP計分(陽性細胞數+染色強度)++～+++++合計對照組19(59.4)4(12.5)9(28.1)32實驗組21(65.6)4(12.5)7(21.9)32

χ2=0.350，P=0.839

2.4 結腸黏膜NO與NOS含量變化

除了近段結腸黏膜nNOS水平，近端、中段結腸黏膜NO含量、nNOS mRNA表達水平在2組間差異無統計學意義。遠端結腸黏膜NO含量、nNOS mRNA表達水平、eNOS陽性細胞分布在2組間差異無統計學意義，見表4。

表4 大鼠結腸黏膜NO ( umol/g protein)、nNOS mRNA(△Ct)和eNOS陽性細胞積分變化

3 討論

復方苯乙哌啶是非特異性止瀉藥，直接作用于腸平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，減弱腸蠕動，并使腸內容物通過延遲，而致便秘[4]。通過飼喂復方苯乙哌啶，90天后大鼠結腸大體形態觀察實驗組結腸較對照組粗大、迂曲，腸腔內有較大塊的糞便存留，腸道傳輸時間顯著延長。2組大鼠結腸黏膜光鏡下病理組織學表現相類似。造模第5天2組間的平均體重和造模第90天2組間的平均體重差異無統計學意義。顯示較長期使用復方苯乙哌啶可致胃腸動力功能障礙，腸內容物滯留于結腸而引起頑固性便秘，與臨床上STC的病理生理過程相類似。但不產生病理組織學損害，不造成體重丟失。

研究表明，胃腸動力功能障礙可能與ENS及其遞質的異常變化有關[2, 4]。ENS由胃腸道、膽胰系統中所含的神經節間網絡組成，對胃腸運動的興奮、調節和抑制起重要作用。ENS具有復雜多樣的神經遞質， 通過對其興奮性遞質和抑制性遞質的調控而達到調節功能的目的。現已證實，NO是胃腸道主要的抑制性NANC遞質[5-6]。當NANC能神經受到刺激時，即釋放NO，使其第二信使環磷酸鳥苷增多，胞漿Ca2+外流并抑制Ca2+內流，致使胞漿游離Ca2+濃度降低，平滑肌舒張，胃腸運動減弱。有報道成人功能性便秘患者結腸粘膜下神經叢和肌間神經叢NOS陽性神經元數量和密度均較正常組明顯增多、增強，粘膜內NO生成量增加[7]。本研究顯示實驗大鼠遠端結腸黏膜NO含量與對照組比較差異無統計學意義，與文獻報道不一致[8]，其原因尚不清楚。

VIP在胃腸運動調節中主要起抑制效應，可通過直接作用于胃腸平滑肌上的VIP受體發揮作用，能引起人結腸平滑肌的舒張[2]。主要支配結腸下行性抑制反射，與結腸節段非推進性運動有關，它的減少會導致結腸節段非推進性運動增多，使結腸出現過度的節段性蠕動，這些腸段的緊縮甚至痙攣使有效推進性運動減弱。我們利用免疫組化技術發現，VIP陽性神經纖維在實驗組大鼠結腸黏膜的分布與對照組無明顯差異。這與文獻資料關于VIP能神經在便秘患者結腸壁內減少似有不符合之處[8]。

SP是興奮性運動神經元遞質，主要存在于肌間神經叢，能抑制胃腸道黏膜分泌，刺激腸道運動。慢傳輸型便秘患兒腹腔鏡結腸活檢，免疫熒光染色法測定，發現SP較正常兒童減少甚至缺乏[2]。本研究顯示遠端結腸黏膜SP含量在實驗組與對照組間的差異無統計學意義，與文獻報道并不一致。

本研究表明，復方苯乙哌啶較長期使用可致腸道傳輸速度明顯減慢，出現結腸動力減弱，造成便秘，但不產生病理組織學損害，不造成體重丟失。對腸神經系統NO、 SP、VIP遞質的產生也無明顯遠期影響，其內在的作用機制尚待進一步研究。

致謝：該研究得到浙江大學醫學院附屬兒童醫院江米足教授和消化實驗室大力支持、指導幫助，特別致謝。

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Long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transit function, colonic histopathology and neurotransmitter in Wister rat

BAO Yunguang, LI Xiaobing, ZHAO Chan

(Jinhua Central Hospital, Zhejiang 321000, China)

R333.3

A

1672-0024(2012)02-0043-04

包云光(1961-)，女，浙江東陽人，本科，主任醫師。研究方向：小兒消化

金華市與浙江大學科技合作專項資金資助(計劃編號:2005-1-303)