組織型激肽釋放酶對腦缺血大鼠神經生長因子的影響

邊 穎，王金春，商艷君

激肽釋放酶-激肽系統(Kallikrein-kinin system，KKS)在人體內分布較廣，可協調機體內多種功能，如穩定血壓、協調內環境、抑制炎性反應及促進血管再生等［1］。中樞神經系統的功能穩定依賴KKS的調控［2］。本實驗通過觀察大鼠的神經功能恢復情況，用免疫組化染色的方法測定神經生長因子(NGF)的表達，以證明其對中樞神經系統損傷修復的作用可能與NGF等神經營養因子有關，為進一步臨床治療提供實驗依據。

1 實驗方法

1.1 實驗動物及分組 Wistar大鼠36只，由中國醫科大學實驗動物中心提供，體質量270～300 g。將36只動物隨機分為3組。空白對照組:改良的Longa［3］栓線法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞(MCAO)模型;鹽水對照組(NS組):大腦中動脈閉塞后8 h，腹腔注射 NS 2 mL/(kg·d);TK治療組(TK組):右側大腦中動脈閉塞后8 h，腹腔注射TK 1 715 ×10-3U/(kg·d)。

1.2 MCAO模型的制作 取成年Wistar大鼠，體質量270～300 g。10%水合氯醛0.35 g/kg，腹腔注射麻醉。小心剝離右側迷走神經與頸總動脈，結扎頸外與頸總動脈，夾閉頸總動脈遠端，用針頭在近結扎線處刺入頸總動脈，將直徑為0.26 mm的魚線插入頸總動脈，前行入頸內動脈，距頸內、頸外動脈分叉處約1.8～2.0 cm感到有阻力時停止，即大腦中動脈區。1 h后去除栓塞線。大鼠蘇醒后，若有追尾現象，原地轉圈，且向左側傾倒，右側Horner征，左前肢屈曲等即表明梗死模型成功。注意魚線不能插入過深，否則易致蛛網膜下腔出血。

2 檢測指標及方法

2.1 神經功能缺失評分 實驗前先對大鼠進行訓練，采用神經損傷評分［4］(NSS)。術后第1天，NSS 8～12分的大鼠進入本實驗。術后第1、3、7天，對3組大鼠進行評分及方差分析。

2.2 腦梗死體積測定 將大腦由額極至枕極分為5枚腦片，2 mm/片，立即置于2%TTC(紅四氮唑)溶液中，37℃水浴30 min，4%多聚甲醛固定30 min。顯微圖像分析系統采集每片腦切片上、下面圖像，分析每片腦切片上、下面腦梗死面積。根據梯形法則計算腦梗死體積。

2.3 免疫組化染色 梗死后3d，將大鼠用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心內灌注后取腦，固定24 h，組織脫水包埋。在梗死灶中心部位，相當于以前囟為中心，冠狀面 +1～-1 mm，每隔100 μm，連續7 μm 切片5張，對NGF進行免疫組化染色。一抗為兔抗NGF(1∶200)，二抗為生物素化羊抗兔IgG。顯色底物為DAB顯色劑。

2.4 NGF測定 將染色后的腦組織切片取梗死周圍皮質，進行顯微圖像采集、分析(Meta Morph/DP10/BX41)，記錄經過處理軟件包量化后的灰度值。2.5 統計學方法 用SPSS11.0統計軟件做方差分析。數據以均數±標準差()表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 NSS評分 3組神經功能缺損減輕。TK組第3天NSS評分與其他2組的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組NSS評分()

表1 各組NSS評分()

注:*與TK組比較，P＜0.05;#與NS組比較，P＞0.05

組別 第1天 第3天 第7天空白對照組 9 8.90±1.12*#9 4.30±0.55 6.48±0.79 7.98±1.23 NS組 9 8.50±0.71* 7.56±0.85 TK組

3.2 動物模型經切片、TTC(紅四氮唑)染色 見圖1～圖2。

圖1 大鼠MCAO模型

圖2 大鼠MCAO模型

3.3 腦梗死體積的比較 3組均有梗死灶形成，但TK組梗死灶體積(30.54% ±3.47%)較NS組、空白對照組(38.43% ±5.73%，39.67%±4.98%)明顯減輕(P＜0.05)。

3.4 缺血區NGF免疫組化結果 大腦中動脈閉塞后腦缺血區NGF增多，而注射TK后，NGF細胞明顯增多，TK組與其他2組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2及圖3～圖4。

表2 各組腦組織切片中NGF灰度值比較()

表2 各組腦組織切片中NGF灰度值比較()

注:*與TK組比較，P＜0.05，#與NS組比較，P＞0.05

1d 3d 7d空白對照組 172.04±0.13*# 166.95±0.57 170.54±1.03*#組別NS組 173.10±0.24* 166.56±0.63*170.94±0.76*TK組166.32±0.37 154.64±0.51 160.86±0.38

圖3 NS組3d NGF的表達(400×)

圖4 TK組3d NGF的表達(400×)

4 討論

有學者提出，腦組織缺血性損傷早期，如果KKS受到激活而參與一系列的生理生化反應，可以加重腦組織損傷，原因為KKS增加通透性和腦水腫［6］。Zausinger等［7］研究顯示，在局灶性腦缺血前30 min給予激肽B2受體拮抗劑(LF16-0687MS)，可加快缺血性腦組織的功能恢復。另外，Xia等［8］提出，在腦組織缺血后 8 h，給予不同的治療，結果不同:注射人TK基因可使大鼠缺血性腦梗死的體積縮小;而LF16-0687MS能加重缺血性腦梗死的再灌注損傷。得出不同的結論與TK治療的時間有關:TK在早期可使腦水腫加重，但后期卻能通過抑制細胞凋亡而起到神經保護作用。倪耀輝等［9］研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注后8 h給予TK，對腦缺血有明顯的治療作用，可減輕炎性反應，同時還能降低梗死灶內的細胞凋亡;明顯增加缺血區神經細胞、神經膠質細胞和血管上皮細胞的增生。因此，推斷TK是通過促進血管、神經組織再生以及抑制局灶缺血區的細胞凋亡、炎性反應而發揮治療作用［10-11］。

本研究顯示，在大鼠大腦中動脈閉塞再灌注后8 h注射TK，可改善大鼠的神經功能缺損，并減少大鼠腦梗死體積，使腦缺血區NGF表達增多。結果表明，在腦缺血較晚期，TK有明顯的治療效果。另外，應用TK治療能明顯增加缺血區的NGF表達，表明腦梗死時，TK有促進神經細胞再生的作用。NGF能加速神經元生長、分化及維持其功能，在腦內能保護神經元抵御很多類型的損傷。因此，得出結論，通過保護神經元、促進軸突再生而減輕中樞神經系統損傷。這為臨床應用TK治療缺血性腦梗死提供了重要的理論依據。

［1］Emami N，Diamandis EP.Human tissue kallikreins:A road under constration［J］.Clin Chim Acta，2007，381(1):78-84.

［2］Yousef GM，Kishi T，Diamandis EP.Role of kallikrein enzymes in the central nervous system［J］.Clin Chim Acta，2003，329(1-2):8171-8174.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson L，et al.Versible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［4］Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2001，32(4):1005-1011.

［5］Gerriets T，Li F，Silva MD，et al.The macrosphere model:evaluation of a new stroke model for permanent middle cerebral artery occlusion in rats［J］.J Neurosci Methods，2003，122(2):201-211.

［6］Lumenta DB，Plesnila N，Klasner B，et al.Neuroprotective effects of a post ischemic treatment with a bradykinin B2 receptor antagonist in a rat model of temporary focal cerebral ischemia［J］.Brain Research，2006，1069(1):227-234.

［7］Zausinger S，Lumenta DB，Pruneaud，et al.Effects of LF 16-0687 Ms，a bradykinin B2 receptor antagonist，on brain edema formation and tissue damage in a rat model of temporary focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2002，950(1-2):268-278.

［8］Xia CF，Yin H，Yao YY，et al.Kallikrein protects against ischemia stroke by inhibiting apoptosis and flammation and promoting angiogenesis and neurogenesis［J］.Human Gene Therapy，2006，17(2):206-219.

［9］倪耀輝，丁素菊.組織型激肽釋放酶對腦缺血再灌注大鼠的治療作用及其機制的探討［J］.臨床神經病學雜志，2009，22(1):44-47.

［10］Kochanek PM，Berger RP，Bayr H，et al.Biomarkers of primary and evolving damage in traumatic and ischemic brain injury:diagnosis，prognosis，probing mechanisms，and therapeutic decision making［J］.Curr Opin Crit Care，2008，14(2):135-141.

［11］張志琳，包仕堯，汪立平，等.星形膠質細胞源性因子對神經干細胞分化的實驗研究［J］.臨床神經病學雜志，2006，19:45-47.