hTERT啟動子引導hNIS基因重組腺病毒介導放射性核素的裸鼠顯像

趙興業，李 瑋，譚 建，王 澎，李 寧

（天津醫科大學總醫院核醫學科，天津300052）

報告基因指其表達產物非常容易被檢測的基因。報告基因顯像則是通過將報告基因轉染給靶細胞后，通過檢測報告基因從而顯影的一種方法。現有的報告基因如熒光素酶、轉鐵蛋白、鈉碘轉運體（NIS）等，可以通過光學成像，核素顯像，MRI等方法進行檢測[1-2]。其中，NIS基因因為可將細胞外的碘轉運進入細胞內，所以可以方便地進行放射性核素顯像。在既往研究中已證明使用脂質體可在體外將NIS基因轉入大細胞肺癌細胞內，用篩選后的腫瘤細胞構建荷瘤裸鼠模型，進行放射性核素顯像[3]。但是，該研究存在脂質體不能進行體內轉染的問題。為解決以上問題，構建重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS（hTERT啟動子引導hNIS基因表達的Adeasy系統重組腺病毒），并利用該重組腺病毒能實現體內靶向hNIS基因表達的特點對端粒酶陽性膠質瘤U87荷瘤裸鼠進行體內轉染及核素顯像。惡性膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，雖然可以通過手術、放療、化療、抗腫瘤藥物得到治療，但是遠期效果很差，致死率高，易發生轉移[4-5]。將hNIS基因作為報告基因的核素顯像技術應用于膠質瘤核素顯像，開拓了靶向性核素顯像的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 U87細胞系由本實驗室保存，并于37℃、5%CO2的培養箱中，使用含10%胎牛血清（fetalbovine serum,FBS）的達氏修正依氏培養液（Dulbecco’smodified Eagle’smedium,DMEM） 中培養。重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS等均由本實驗室保存。BALB/c品系裸鼠購自中國醫學科學院中國協和醫科大學北京實驗動物中心,飼養于天津醫科大學實驗動物中心。SPECT（Discovery VH）為美國GE公司產品。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的擴增 將U87細胞接種于25 cm2培養瓶中，培養24 h至細胞達到60%融合。取病毒液Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR感染U87細胞，待轉染7~10 d后，收集細胞并反復凍融，12 000 r/min離心后收集病毒上清。如此反復數次后，擴增病毒至所需滴度，即5×109PFU。

1.2.2 測定轉染后U87細胞攝碘率[6]將U87細胞在6孔板上培養至80%融合，Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR按50感染復數（multiplicity of infection,MOI）的病毒梯度來轉染并孵育1 h后更換為10%FBS的新DMEM培養基，繼續培養24 h后，進行攝碘率測定。將18.5 kBq125I/孔U87細胞孵育40min，使用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS）沖洗2遍后，使用γ計數器測定每孔細胞的每分鐘放射性計數(countperminute,CPM)值。

1.2.3 Western blot檢測hNIS蛋白表達 提取細胞總蛋白，然后采用10%十二烷基硫酸鈉--聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluioride,PVDF）膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜。選取Santa cruz公司的sc-48055為NIS基因一抗，美國Santa cruz的sc-2004為NIS基因二抗。然后加入ECL化學發光反應液（美國Thermo），室溫1min。

1.2.4 膠質瘤荷瘤動物模型的構建 選取4周齡BALB/c雌性裸鼠每組4只，將1mL約5×106的U87膠質瘤細胞進行右肩胛皮下注射，當裸鼠皮下腫瘤長至直徑10mm（約注射后3周），將重組腺病毒 Ad-hTERT-hNIS和 Ad-CMV-EGFR（5×109PFU/50μLPBS）分別進行裸鼠瘤內注射。U87細胞接種裸鼠同時開始封閉甲狀腺，在裸鼠飲水中加入優甲樂（L-T4）5mg/L，持續至實驗結束，以減少甲狀腺攝碘量從而最大限度地增加轉染腫瘤的攝碘率。

2 結果

2.1 測定U87細胞攝碘率 轉染Ad-hTERT-hNIS的U87細胞系的攝125I活性為 10 569.3±203.2，轉染Ad-CMV-EGFR的U87細胞系的攝125I活性為480.0±25.7。轉染hNIS基因后的U87細胞攝碘能力較對照組提高約22倍左右（t=101.23，P<0.01），表明經重組腺病毒轉染后的hNIS基因具有攝碘功能；hTERT啟動子在腫瘤細胞內能夠有效地啟動hNIS基因表達。

2.2 Western blot檢測 使用 Western blot分析hNIS基因蛋白質表達水平。在U87細胞系中，hNIS蛋白在70 kDa有表達帶，見圖1。

3 討論

報告基因顯像是一種分子水平顯像方法。隨著研究的深入，人們逐漸發現了一些問題：如現有的報告顯像基因進入人體需要合適的載體。目前常用的載體有脂質體和病毒，但可惜的是，脂質體載體不能進行基因活體轉染；病毒載體中腺病毒等非逆轉錄病毒載體只能實現瞬時表達[8]；慢病毒載體等逆轉錄病毒載體，雖能實現穩定表達，但因其安全性問題和出毒量低等問題，也不十分理想。

PET和SPECT等核醫學設備因具有高靈敏度更方便進行相關報告基因顯像[9]。NIS基因已經被證明具有作為報告基因的潛力。NIS基因能表達一種膜蛋白并將細胞外碘轉入細胞內，該蛋白能介導放射性核素進行顯像，如適用于SPECT的131I和123I，適用于PET的124I等。雖然NIS最重要的生理作用是轉運碘，但也能轉運其他結構類似的陰離子，如不僅與碘具有類似的理化性質，而且在放射性核素顯像中具有相似的生物分布，所以同樣可用于顯像[10]。NIS基因作為一種報告基因具有非免疫原性、生理性表達只限于特定組織器官的優點[11]。

hTERT啟動子等腫瘤特異性啟動子，用來在膠質瘤中誘導特定基因表達的基因治療已得到了證實[12]。如Takeuchi等[13]已證實使用hTERT啟動子系統誘導半胱天冬酶 (caspase)治療膠質瘤獲得成功等。hTERT啟動子在腫瘤目標性治療中是一個很有希望的腫瘤選擇性啟動子[14-15]。

此次研究是利用重組腺病毒在端粒酶陽性的膠質瘤U87荷瘤裸鼠進行體內轉染及核素顯像的可能性進行的。在前期研究中已發現使用hTERT啟動子限制hNIS基因表達的腺病毒Ad-hTERT-hNIS，可以實現在端粒酶陽性的膠質瘤細胞中引導hNIS基因的表達，而在端粒酶陰性的MRC-5細胞中則不能達到表達hNIS基因的目的。通過進行體內顯像實驗，發現Ad-hTERT-hNIS轉染荷瘤裸鼠24 h后可以實現荷瘤裸鼠體內轉染和顯像，但因為載體本身的限制，顯像時間很有限，超過一定時間后就不再能進行顯像。因為正常甲狀腺組織具有選擇性攝取和濃聚99Tcm的能力，雖然事先對裸鼠的甲狀腺進行了左甲狀腺素屏蔽，但是屏蔽效果不理想，在裸鼠顯像中仍可看見裸鼠甲狀腺顯影。這都是在今后需要研究的問題。

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