基于tufA基因的泡狀饒氏藻系統發育分析

翟麗莎，馮 佳，謝樹蓮

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

泡狀饒氏藻[Jaoa bullata(Jao)Fan］屬綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)。該種于1947年由饒欽止先生從貴州省湄潭縣小河急流中的巖石上發現并命名為 Coelodiscus bullatus[1］，隸屬饒先生之前建立的空盤藻科(Coelodiscaceae)空盤藻屬(Coelodiscus)[2-4］。泡狀饒氏藻和饒氏藻[Jaoa prasina(Jao)Fan］是饒氏藻屬僅有的2個種，為我國特有種(也有文獻認為泡狀饒氏藻只是饒氏藻的1個變種[5-7］)。自該科屬建立以來，有的將其歸于絲藻 目 (Ulotrichales)[8］，有 的 歸 于 膠 毛 藻 目(Chaetophorales)[5，6］，有的歸于 Ctenocladales[7］.也有根據形態特點，將其歸于石莼目(Ulvales)[9，10］。可見，其系統位置一直是一個存在爭議的問題。

tufA基因是葉綠體基因組中4個翻譯因子基因的其中之一，編碼翻譯延長因子亞基，具有促進翻譯的功能。tufA已被用于區別綠藻物種的系統發育分析[11］。Gary的研究表明，tufA基因具有高辨識力、普遍性及好的序列質量，且污染水平較低[12］。

以往對饒氏藻的研究多在形態解剖結構方面[9，13-14］。筆者通過試驗測定了泡狀饒氏藻的tufA基因序列，并與Genbank獲得的綠藻門其它類群的基因序列構建系統樹，分析它們之間的關系，以期為進一步研究饒氏藻的系統位置提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為泡狀饒氏藻，采自山西省平定縣娘子關泉。樣品采集后，用于形態觀察的標本保存于4%的福爾馬林溶液中;用于DNA分析的材料在解剖鏡下挑除雜質，用硅膠粉干燥貯存;憑證標本保存于山西大學植物標本館。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA的提取

取一定量的干燥藻體于液氮中研磨，然后轉至1.5 mL離心管中，用SDS法提取基因組總DNA.

1.2.2 DNA 的電泳檢測

將提取的DNA產物進行0.8% ～1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢定樣品DNA的完整性。

1.2.3 PCR 擴增

查閱相關文獻[15］，確定引物。正向引物t36F:5'-GTTAAYATTGGAACWATTGG-3'和反向引物t1070R:5'-CCATCATCAGCWGTRAATTG-3'.

擴增反應在美國BIO-RAD公司生產的PCR儀上進行。反應體積為 25 μL，包括 1.0μL DNA 模板，2.5 μL引物 t36F，2.5 μL 引物 t1070R，2.0 μL 10 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10 × buffer( 含 Mg2+)，14.3 μL ddH2O 及 0.2 μL Trans TaqTDNA 聚合酶(北京全式金生物技術有限公司)。擴增程序為:95℃，10 min預變性。循環溫度94℃，1 min;52℃，1 min;72℃，1 min;35個循環。最后72℃延伸5 min.得到的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶切割后參照DNA純化試劑盒使用說明進行純化回收。

1.2.4 序列測定

序列測定由北京奧科鼎盛生物技術有限責任公司完成。

1.2.5 獲得相關序列

從GenBank中獲得相關基因序列，登錄號見表1.

1.2.6 軟件分析

應用Clustal X2.0將所測序列與GenBank中所得序列進行比對[16］，人工檢查比對結果的正確性，并采用MEGA 4.0計算序列組成。構建系統樹，其節點支持率使用1 000次自展(Bootstrap，BP)檢驗。利用MrBayes3.0，Phyml3.0 和 PAUP*4.0b10 軟件分別重建系統發育樹，采用貝葉斯法(Bayes)[17］、最大似然法(ML)和最大簡約法(MP)3種建樹方法。

2 結果與分析

2.1 序列分析

對tufA基因序列分析測得的片段長度為957 bp.tufA 堿 基 組 成 為 A34.6%，T30.1%，C15.0%，G20.3%.A+T 含量(64.7%)明顯大于C+8G含量(35.3%)，說明tufA基因在進化上具有堿基偏好性。

表1 試驗所用基因序列GenBank登錄號

2.2 系統樹發育分析

以較為原始的團藻目中的Chlamydomonas reinhardtii和Volvox carteri為外類群，用貝葉斯法、最大似然法和最大簡約法分別計算得到Bayes樹，ML樹和MP樹，如圖1，圖2，圖3.圖中節點處數字代表1 000次重復(Botstrap，BP)分析得到的支持率(%)。

圖1 基于tufA基因的Bayes樹

比較圖1和圖2可知，Bayes樹和ML樹的拓撲結構基本一致。可以看出，泡狀饒氏藻與絲藻目的Ulothrix zonata親緣關系較近，但兩種方法構建的系統樹自展支持率較低，分別為52%和47%.另外，從系統樹位置上看，泡狀饒氏藻與鞘藻目(Oedogonia-les)的Oedogonium cardiacum和膠毛藻目的Draparnaldia plumosa也比較接近，而與石莼目的種類關系較遠。MP樹(圖3)顯示的結果與前兩者略有不同，泡狀饒氏藻單獨稱為一支，但仍與鞘藻目、膠毛藻目的種類較為接近。

圖2 基于tufA基因的ML樹

圖3 基于tufA基因的MP樹

3 結論與討論

對于饒氏藻科分類系統的研究，以往都是從形態和解剖方面分析探討的。Papenfuss和石登紅等根據饒氏藻科植物體不具分枝及植物體呈假薄壁組織狀的形態特征，認為與絲藻目植物不具分枝的絲狀體或膜狀體相似[8-14］，但二者在藻體大小及復雜程度上相差甚遠。Printz主張將饒氏藻科列入膠毛藻目[6］，雖然該目植物體結構較復雜，但其具有異絲體性分枝的特征似也與饒氏藻科有很大的不同。Silva則認為饒氏藻科尚未獲得廣泛承認，應將其放在一個分類很不穩定的Ctenocladales中[7］。王模善等從饒氏藻科的藻體形態和超微結構入手，認為將其歸于石莼目更合適[9］，但筆者的試驗結果卻不支持這個觀點。筆者對泡狀饒氏藻的tufA基因進行分析，顯示其與絲藻目、鞘藻目和膠毛藻目有一定關系，但未獲得較高的支持率。鑒于目前tufA基因用于藻類系統發育的研究報道較少，涉及到的種類較有限，有必要進行更多的基因序列分析，并將傳統方法和現代分子生物學方法科學地結合起來，才可能對饒氏藻科的分類地位得到更全面、客觀的結論。本試驗結果也為tufA基因用于藻類植物系統發育研究的可行性提供了證據。

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