咖啡酸維生素C酯的合成、抑菌活性和抗氧化性研究

劉菊香，范廣璞，劉長春

(江蘇食品職業技術學院生物與化學工程學院，江蘇淮安 223003)

咖啡酸維生素C酯的合成、抑菌活性和抗氧化性研究

劉菊香，范廣璞，劉長春*

(江蘇食品職業技術學院生物與化學工程學院，江蘇淮安 223003)

研究了以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素C為原料，經過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成咖啡酸維生素C酯的方法，并考察了咖啡酸維生素C酯的抑菌活性和抗氧化性。在催化劑SO42－/ZrO2的作用下，3，4－二羥

基苯甲醛與丙二酸首先發生Knoevenagel縮合生成咖啡酸，產物不需要分離，加入維生素C繼續進行酯化反應，以85.1%的產率得到了咖啡酸維生素C酯，產物結構用1H NMR和IR進行確證。抑菌活性實驗表明，咖啡酸維生素C酯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母、青霉、黃曲霉和黑曲霉均有較強的抑制作用，對細菌和酵母的抑制作用高于霉菌。抗氧化性實驗表明，咖啡酸維生素C酯可以有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于維生素C。

咖啡酸維生素C酯，咖啡酸，維生素C，抑菌活性，抗氧化性

咖啡酸及其酯具有較強的抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性和抗腫瘤作用［1－3］，藥理活性非常廣泛，是近年來新藥研發的熱點化合物，在醫學上具有廣闊的應用前景。維生素C是一種人體必需的水溶性維生素，具有優良的抗氧化性，目前廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域。維生素C的水溶性和不穩定性限制了它的應用范圍，減弱了其使用功效。維生素C酯是維生素C的一種重要衍生物［4］，它不僅保持了維生素C的抗氧化性能和生理活性，而且在非水體系中的溶解性和穩定性均有顯著提高，增加了對自由基的清除能力，已經成為一種高效、安全、無毒的抗氧化劑。為了獲得一種兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加劑，我們設計將咖啡酸與維生素C兩個活性結構單元相結合合成咖啡酸維生素C酯。維生素C酯的合成方法主要有化學法合成和酶法合成。傳統化學法合成通常以維生素C和羧酸或羧酸酯為原料，用濃硫酸作催化劑，經直接酯化或酯交換得到維生素C酯［4－8］，反應時間長，酯產率低，環境污染嚴重。酶法合成則是采用脂肪酶作催化劑合成維生素C酯［9－11］，反應條件溫和，產物選擇性高，但反應時間長，反應收率低，催化劑成本高。固體酸催化劑SO42－/ZrO［212］在Knoevenagel縮合反應中得到廣泛應用，獲得了較好的使用效果。我們已將SO42－/ZrO2用于催化Knoevenagel縮合和酯化反應一鍋法合成α－呋喃丙烯酸丁酯［13］，催化活性高，產率高，選擇性好，回收處理簡單，具有良好的重復使用性能。本文以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素 C 為原料，SO42－/ZrO2作催化劑，經過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成咖啡酸維生素C酯，用1H NMR和IR對其結構進行表征，并考察了其抑菌活性和抗氧化性。合成路線如圖1所示。

圖1 咖啡酸維生素C酯的合成Fig.1 Synthesis of caffeic acid vitamin C ester

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Nicolet 5－DX紅外光譜儀、KBr壓片 美國Nicolet公司;AVANCE 400核磁共振儀 TMS作內標，CDCl3作溶劑，瑞士Bruker公司;X－4型顯微熔點儀 北京泰克儀器有限公司;722S型分光光度計上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡酸維生素C酯的合成

1.2.1.1 合成方法 在裝有回流冷凝管的三口燒瓶中，加入 3，4－二羥基苯甲醛 10mmol，丙二酸10mmol，催化劑96mg和乙腈20m L，通氮氣保護，攪拌回流反應1h。加入維生素C 12mmol，在氮氣保護下于60℃繼續反應3h。反應液冷卻至室溫，過濾分離出催化劑，用乙腈洗滌，可以循環使用。將濾液與洗滌液合并，依次用冰冷飽和NaHCO3溶液和冰水洗滌，用無水MgSO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物用乙酸乙酯重結晶，得到白色固體咖啡酸維生素C酯，產率85.1%(按3，4－二羥基苯甲醛計)，m.p.192～193℃。1H NMR(CDCl3)δ:4.31～4.40(m，2H，OCH2)，4.62(t，1H，OCH)，4.86(d，1H，COOCH)，5.27(s，1H，OH)，6.34(d，1H，COCH=)，6.85～7.01(m，3H，ArH)，7.52(d，1H，=CH)，9.12(s，2H，ArOH)，10.95 (s，2H，=COH);IR(KBr，cm－1)υ:3386，2931，1728，1652，1467，1161.

1.2.1.2 反應條件的確定

反應物用量:固定 3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，催化劑用量96mg，縮合反應時間1h，酯化反應溫度60℃和反應時間3h，分別改變丙二酸和維生素C用量為10、11、12、13mmol，按1.2.1.1中方法進行實驗。

催化劑用量:固定 3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，縮合反應時間1h，酯化反應溫度60℃和反應時間3h，改變催化劑用量為48、72、96、120mg，按1.2.1.1中方法進行實驗。

縮合反應時間:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，酯化反應溫度60℃和反應時間3h，改變縮合反應時間為0.5、1.0、1.5、2.0h，按1.2.1.1中方法進行實驗。

在“您認為您所在的區域教研組是一個什么樣的組織”一題中，62.3%的教師選擇了“非行政性學科專業組織”這一選項。可見，雖然教研組在學校里還承擔著一定的行政事務，但廣大教師對教研組在教學研究中發揮更大作用的期待越來越明顯。建設基于學科的區域教研不僅是新課改對于學科建設的需求，同時更是一線教師對學科教研組在其專業發展過程中發揮積極促進作用的需求。

酯化反應溫度:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，縮合反應時間1h，酯化反應時間3h，改變酯化反應溫度為50、60、70、80℃，按1.2.1.1中方法進行實驗。

酯化反應時間:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，縮合反應時間1h，酯化反應溫度60℃，改變酯化反應時間為1、2、3、4h，按1.2.1.1中方法進行實驗。

1.2.2 抑菌活性的測定 選擇金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉等7種常見的食品致腐菌為受試菌，采用抑菌圈法測定咖啡酸維生素C酯的抑菌活性，具體測試方法見文獻［15］。將目標化合物進行倍比稀釋，根據抑菌圈的有無確定最低抑菌濃度(MIC)。根據抑菌圈直徑(D)大小計算抑制率，測試濃度為50mg/m L。

1.2.3 抗氧化性能的測定 按文獻［5］測定咖啡酸維生素C酯對羥基自由基和DPPH自由基的清除活性，并與維生素C的清除活性進行比較。測定清除羥基自由基活性時，測試濃度為1、2、4、6、8、10mmol/L，以不含樣品的溶液為對照，不含樣品和H2O2的溶液為空白。測定清除DPPH自由基活性時，測試濃度為10、20、40、60、80、100μmol/L，以不含樣品的溶液為空白。根據測得的吸光度(A)計算目標化合物對羥基自由基和DPHH自由基的清除率。

2 結果與討論

2.1 咖啡酸維生素C酯的合成

考慮到乙腈的極性很強，對反應物有較好的溶解性，而且其沸點可以滿足反應需要，因而選擇乙腈作為反應溶劑。Knoevenagel縮合通常在較高的溫度下進行，加上縮合產物需要脫去一個羧基，所以我們選定縮合反應在回流條件下進行。在此基礎上，本實驗考察了反應物用量、催化劑用量、縮合反應時間、酯化反應溫度和反應時間等因素對咖啡酸維生素C酯產率的影響。

反應物用量對目標產物產率的影響見表1。從表1可以看出，隨著丙二酸用量的增加，目標產物的產率逐漸降低，這是因為過量的丙二酸會在下一步反應中與維生素C發生酯化生成丙二酸維生素C酯，不利于咖啡酸維生素C酯的生成，使咖啡酸維生素C酯的產率降低，而且導致產物難以分離，目標產物純度不高。增加維生素C的用量有利于酯化反應進行完全，目標產物的產率也逐漸提高，但是當維生素C用量增加到12mmol后，目標產物的產率增加并不顯著。

表1 反應物用量對咖啡酸維生素C酯產率的影響Table 1 Effect of reactant amount on the yield of caffeic acid vitamin C ester

催化劑用量對目標產物產率的影響見表2。結果表明，增加催化劑的用量有利于縮合和酯化反應的進行，這是由于隨著催化劑用量的增加，催化劑的活性中心和有效比表面積逐漸增加，從而增加了反應物在催化劑表面發生反應的機會，使目標產物的產率得以提高。當催化劑用量大于96mg，可能因為催化劑的活性太高，促進了維生素C和咖啡酸維生素 C酯的氧化，目標產物的產率反而有所降低。

表2 催化劑用量對咖啡酸維生素C酯產率的影響Table 2 Effect of catalyst dosage on the yield of caffeic acid vitamin C ester

縮合反應時間對目標產物產率的影響見表3。結果顯示，縮合反應在較短的時間(1h)內就可以完成，繼續延長縮合反應時間，目標產物的產率無明顯提高。

表3 縮合反應時間對咖啡酸維生素C酯產率的影響Table 3 Effect of condensation reaction time on the yield of caffeic acid vitamin C ester

酯化反應溫度對目標產物產率的影響見表4。從表4可以看出，反應溫度為60℃，酯化反應結果最好。酯化反應溫度過低，酯化反應不能進行完全，目標產物的產率較低。酯化反應溫度過高，由于維生素C和咖啡酸維生素C酯發生氧化等副反應，導致目標產物的產率下降。

表4 酯化反應溫度對咖啡酸維生素C酯產率的影響Table 4 Effect of esterification reaction temperature on the yield of caffeic acid vitamin C ester

酯化反應時間對目標產物產率的影響見表5。結果表明，酯化反應時間過短，酯化反應不能進行完全，目標產物的產率較低。反應時間為3h時，目標產物的產率最高。繼續延長酯化反應時間，目標產物的產率反而有所下降。

表5 酯化反應時間對咖啡酸維生素C酯產率的影響Table 5 Effect of esterification reaction time on the yield of caffeic acid vitamin C ester

將反應結束后分離出的催化劑用乙腈洗滌，循環使用于咖啡酸維生素C酯的合成，結果見表6。實驗結果表明，SO42－/ZrO2回收處理簡便，重復使用性能良好，重復使用6次后，仍具有較高的催化活性。

表6 催化劑的重復使用結果Table 6 Results of reuse of catalyst on synthesis of caffeic acid vitamin C ester

2.2 抑菌活性

采用抑菌圈法測定了咖啡酸維生素C酯對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉等7種受試菌的最低抑菌濃度(MIC)和抑制率，結果見表 7。測試結果表明，濃度為50mg/m L的咖啡酸維生素C酯對所有受試菌均有較強的抑制作用，尤其對細菌和酵母的抑制作用更高，抑制率達80%以上。從最低抑菌濃度大小來看，細菌和酵母對目標化合物也表現出較高的敏感性。

表7 咖啡酸維生素C酯的抑菌活性Table 7 Antibacterial activities of caffeic acid vitamin C ester

2.3 抗氧化活性

DPPH自由基被廣泛用于定量測定生物試樣、酚類物質和食品的抗氧化活性，羥基自由基清除率是反映物質抗氧化作用的重要指標。因此，我們將咖啡酸維生素C酯配制成不同的濃度，測定其對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，并與維生素C的抗氧化性進行對照，結果見圖1和圖2。結果表明，咖啡酸維生素C酯具有優良的抗氧化活性，能有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于對照樣品維生素C，清除DPPH自由基比清除羥基自由基需要的樣品濃度低。隨著樣品濃度的增加，DPPH自由基和羥基自由基的清除率均明顯增加。當咖啡酸維生素C酯濃度為60μmol/L時，DPPH自由基的清除率已達88.6%，再增加咖啡酸維生素C酯的濃度，DPPH自由基清除率變化不大。濃度為10mmol/L的咖啡酸維生素C酯對羥基自由基的清除率為87.5%。

3 結論

圖1 咖啡酸維生素C酯對DPPH自由基的清除活性Fig.1 DPPH free radical scavenging activityof caffeic acid vitamin C ester

圖2 咖啡酸維生素C酯對羥基自由基的清除活性Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging activity of caffeic acid vitamin C ester

以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素C為原料，SO42－/ZrO2作催化劑，經過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成了咖啡酸維生素C酯，實現了將咖啡酸與維生素C兩個活性結構單元結合在一起的目標，開創了一種合成新型食品添加劑的新方法。抑菌活性測試結果顯示，濃度為50mg/m L的咖啡酸維生素C酯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母、青霉、黃曲霉、黑曲霉等均具有較強的抑制作用，抑制率分別為 91.7%、89.2%、81.0%、83.5%、76.3%、52.7%、70.6%，最低抑菌濃度分別為0.776、0.388、0.388、0.194、1.552、12.416、3.104mg/m L。抗氧化性測試結果表明，咖啡酸維生素C酯可以有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于對照樣品維生素C，清除DPPH自由基比清除羥基自由基需要的樣品濃度低。因此，咖啡酸維生素C酯是一種潛在的兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加劑。

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Synthesis，antibacterial and antioxidant activity of caffeic acid vitam in C ester

LIU Ju－xiang，FAN Guang－pu，LIU Chang－chun*
(School of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China)

A facile one－potmethod for synthesis of caffeic acid vitam in C ester via Knoevenagel condensation and esterification from 3，4－d ihyd roxybenzaldehyde，malonate and vitam in C were stud ied.Antibac terialand antioxidant activity of caffeic acid vitam in C ester were determ ined.In the p resence of SO42－/ZrO2catalyst，caffeic acid was synthesized by Knoevenagel condensation of 3，4－d ihyd roxybenzaldehyde w ith malonate，then esterified w ith vitam in C to give caffeic acid vitam in C ester in 85.1%yield.The struc ture of target com pound was confirm ed by1H NMR and IR spec trum.The antibac terial tests ind icated that caffeic acid vitam in C ester exhib ited good inhib ition activity on Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Bacillus sub tilis，Saccharom yces cerevisiae，Penicillium chrysogenum，Asperg illus flavus and Aspergillus niger.And the inhib ition ac tivity of caffeic acid vitam in C ester on bacteria and yeastwere much higher than those on mould.The antioxidant tests indicated that caffeic acid vitam in C ester could efficiently scavenge DPPH free rad ical and hyd roxyl free rad ical，which was significantly higher than that of vitam in C.

caffeic acid vitam in C ester;caffeic acid;vitam in C;antibac terial activity;antioxidant activity

TS202.3

B

1002－0306(2012)19－0218－04

2012－03－27 *通訊聯系人

劉菊香(1965－)，女，實驗師，主要從事食品添加劑的開發研究。