米曲霉固態發酵降解大豆致敏原條件的優化

黃 穎，錢 和，*，汪何雅，張偉國，畢井輝

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122)

米曲霉固態發酵降解大豆致敏原條件的優化

黃 穎1，錢 和1，*，汪何雅1，張偉國2，畢井輝1

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122)

為了最大程度地降低甚至消除米曲霉固態發酵豆粕產品的免疫反應性，此研究利用響應面法對米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的條件進行了優化。首先對影響米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的幾個因素(發酵時間、接種量、發酵溫度、培養基初始pH、料水比)進行了單因素研究，確定了對結果有較大影響的料水比、發酵溫度和培養基初始pH這三個因素。其后利用Box－Behnken設計，確定了固態發酵的最佳條件，即當料水比為1∶1.21(g/mL)、發酵溫度29.8℃、pH為6.63時，得到理論最低致敏原降解率為99.15%。最后，經驗證實驗，最佳條件下實際平均致敏原降解率為99.02%。驗證實驗結果與理論值相差0.13%，說明該方程與實際情況擬合較好。

大豆致敏原，降解，米曲霉，固態發酵，響應面法

大豆這一經濟的植物蛋白資源因其豐富的營養價值和優良的加工特性被廣泛應用于食品工業。但是，近年來大豆因其引發的食物過敏反應逐漸增多，已被世界糧農組織與世界衛生組織列為八大食品致敏原之一［1］。截止到2010年4月16日，致敏原數據庫已收錄38種大豆過敏原［2］。目前，對于大豆過敏患者而言，杜絕攝入含有大豆成分的食品是其避免引發過敏反應的最佳途徑。然而，隨著食品種類多樣性以及食品成分復雜性的情況日益凸顯，降低甚至去除大豆類食品中大豆致敏原的致敏性，則成為當前急需解決的問題。微生物發酵可以提高食品的營養性和功能性。蛋白經過微生物發酵后轉化為小分子多肽及氨基酸，因此它可以作為降解食品過敏蛋白的一種研究方法。Tsuji、Kobayashi和Yamanishi等［3－5］的研究發現，豆類食品在發酵過程中微生物產生蛋白酶，其可以將大豆中的主要過敏蛋白(Gly m Bd 30K)水解成多肽，從而降低其致敏性。另外，胡曉萍［6］和 Frias等［7］用不同微生物對大豆粉或破碎的大豆進行發酵，發現發酵產物的免疫反應性均有不同程度地降低。目前國內外大豆脫敏的研究大多集中在物理、化學法和酶法方面［8－10］，在發酵法降低大豆過敏原方面的信息還很少［11］，發酵法降低或脫除大豆蛋白抗原性的研究仍然需要進一步探索。基于先前運用不同菌種固態發酵豆粕降解大豆致敏原的初步篩選結果，本研究通過單因素實驗和響應面分析對其中效果相對顯著的米曲霉進行發酵條件優化，以期最大程度地降解大豆致敏原，為生產低敏甚至脫敏的大豆發酵產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非轉基因大豆粕 食品級，秦皇島金海食品工業有限公司，水分11.13%、蛋白質 48.45%、灰分7.17%;米曲霉(Aspergillus oryzae) 江南大學生物工程學院代謝調控與代謝工程研究室保藏菌種;斜面培養基 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PDA)，0.1MPa滅菌20min;發酵培養基 250mL三角瓶中豆粕10g，料水比1.0∶1.0，初始 pH 為 7.0，0.1MPa滅菌 20min;96孔聚苯乙烯酶標板 美國Costar公司;羊抗兔HRP標記抗體IgG Sigma公司;EL－TMB顯色試劑 上海生工生物工程有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司;生物安全柜 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;霉菌培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;ALPHA 1－4 LSC冷凍干燥機 德國Christ公司;Eppendorf 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo公司;隔水式電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠;水浴恒溫振蕩器 無錫沃信儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將米曲霉斜面保藏菌種接種于PDA斜面，28℃恒溫培養72h。

1.2.2 孢子懸浮液制備 用無菌生理鹽水沖洗活化好的米曲霉斜面并且適當稀釋后，通過血球計數板計數，將孢子菌懸液的濃度調整為4×108個/mL，4℃保存備用。

1.2.3 米曲霉固態發酵豆粕條件優化 首先通過單因素實驗，見表1，在接種量、培養基初始 pH、料水比、發酵溫度、發酵時間等眾多因素中篩選出對降解大豆致敏原有顯著影響的因素。然后在單因素實驗的基礎上，采用Box－Behnken Design(BBD)，以篩選出的因素為自變量，以發酵豆粕中大豆致敏原降解率為響應值，根據Design－Expert V8.0.6軟件所提供的實驗表進行實驗，見表2、表3，并運用此軟件對實驗數據進行回歸擬合和方差分析，從而得出各自變量水平的最優值，以確定米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的最佳工藝條件。

表1 單因素實驗設計Table 1 Single factor experiment design

1.2.4 驗證實驗 根據單因素實驗和Box－Behnken實驗所得優化結果進行驗證實驗，以驗證在米曲霉的最優發酵條件下，發酵豆粕中大豆致敏原降解率的實測值與回歸模型預測值的擬合度。

1.2.5 豆粕中大豆致敏原的提取 原豆粕和發酵豆粕經冷凍干燥后，粉碎過60目篩，豆粕粉中大豆致敏原的提取采用先變性提取后復性處理［12－13］的方法。具體步驟如下:稱取1g豆粕粉于50mL圓底離心管中，加入 5mL Tris－HCl緩沖液(0.05mol/L，pH8.6)，37℃，150r/min提取1h。然后加入15mL變性劑，即含有13mol/L尿素、0.02mol/L DTT的Tris－HCl緩沖液(0.05mol/L，pH8.6)，充分混勻并將pH校正為8.6后，放入恒溫水浴振蕩器中，100℃，150r/min變性提取1h，再置于50℃水浴鍋內。隨后用180mL已預熱至50℃的復性劑(0.055mol/L NaCl、7.4mmol/L胱氨酸，pH9.0)，將離心管中的提取液轉移至250mL錐形瓶內以復性。復性結束后，將樣品冷卻至室溫，過濾，濾液分裝貯存于－20℃待測。

1.2.6 發酵前后大豆致敏原的檢測 依照1.2.5中所述方法從原豆粕中大量提取大豆致敏原經冷凍干燥制得標準抗原。發酵前后大豆致敏原的檢測采用間接競爭 ELISA 法［14］。

1.2.6.1 包被 標準抗原經pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為0.5μg/mL，100μL包被于96孔酶標板中，4℃放置16h。

1.2.6.2 競爭抗原與抗體的預反應 以含0.1%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L，pH7.4的PBS)為稀釋液，將標準抗原及樣品進行一系列稀釋后加入反應管中，并等體積加入1∶30000稀釋的一抗，微型振蕩器上混勻后，于4℃放置16h。同時以稀釋液代替樣品加入反應管中與等體積抗體混合作為陰性對照，稀釋液作為空白對照。

1.2.6.3 洗滌 用含有0.1%吐溫20的PBS溶液(PBST)洗板 3 次，300μL/孔，每次 3min，拍干。

1.2.6.4 封閉 以含有1%BSA的PBS溶液作為封閉液加入酶標板中，200μL/孔，37℃恒溫箱封閉2h。1.2.6.5 洗滌 同1.2.6.3。

1.2.6.6 加樣反應 將1.2.6.2中經過預反應的抗原抗體混合物、陰性對照、空白對照加入酶標板，100μL/孔，37℃恒溫箱孵育 2h。

1.2.6.7 洗滌 同1.2.6.3。

1.2.6.8 加酶標二抗:向酶標板中加入5000倍PBST稀釋的羊抗兔HRP標記抗體IgG，100μL/孔，37℃恒溫箱孵育1h。

1.2.6.9 洗滌 方法同1.2.6.3，洗滌5次。

1.2.6.10 顯色 每孔加入100μL TMB顯色液，37℃恒溫箱中避光顯色20min。

1.2.6.11 終止測定 每孔加入50μL 2mol/L H2SO4終止反應后，于酶標儀檢測其OD450值。

1.2.6.12 數據處理 根據標準曲線，計算出發酵前后豆粕中大豆致敏原含量［10］，大豆致敏原降解率(%)=(1－發酵豆粕中大豆致敏原含量/原豆粕中大豆致敏原含量)×100

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量對致敏原降解率的影響 當培養基初始pH為7.0，料水比為1.0∶1.0(g/mL)時，分別接入1mL不同濃度的孢子懸浮液，于30℃霉菌培養箱中發酵96h，考察不同接種量對米曲霉降解大豆致敏原的影響，結果見圖1。

圖1 接種量對米曲霉降解大豆致敏原的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

豆粕發酵時，一定范圍內，適當地增大接種量可以縮短發酵周期，加速代謝產物的形成，尤其是蛋白酶系的產生，可以使豆粕蛋白得到最大程度的水解，從而也加大了對致敏原中抗原決定簇降解的幾率。而接種量過大，會引起溶氧不足，影響產物合成;過小，發酵周期延長，對豆粕蛋白降解不足，從而影響對致敏原的降解效果。

由圖1可知，當接種量低于1×108個時，致敏原降解率隨著接種量的增加而逐漸增加。當每10g豆粕接入1×108個米曲霉孢子時，降解率達到最大，為87.35%;此后，接種量繼續增加時，降解率則有所下降。因此，選擇接種量為每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個。

2.1.2 培養基初始pH對致敏原降解率的影響 料水比為1.0∶1.0(g/mL)，10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個，于30℃霉菌培養箱中發酵96h，考察培養基不同初始pH對米曲霉降解大豆致敏原的影響，結果見圖2。

圖2 培養基初始pH對米曲霉降解大豆致敏原的影響Fig.2 Effect of initial pH on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

由圖2可知，培養基的初始pH對大豆致敏原的降解有顯著影響。初始pH過高和過低都會影響米曲霉的生長及所產酶系的活力，不利于大豆致敏原的降解。當初始pH處于6～7這一區間時，致敏原降解率較高;并在pH為6.5時達到最高為89.68%。

2.1.3 料水比對致敏原降解率的影響 當培養基初始pH為6.5時，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個，于30℃霉菌培養箱中發酵96h，考察培養基不同料水比對米曲霉降解大豆致敏原的影響，結果見圖3。

圖3 料水比對米曲霉降解大豆致敏原的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

由圖3可知，培養基的料水比對大豆致敏原的降解也極為顯著。料水比過低，不利于豆粕中營養物質的溶出，使米曲霉對豆粕的利用率降低;料水比過高，培養基易結塊，通氣性降低，不利于米曲霉這一好氧菌的生長繁殖。當料水比為1.0∶1.0～1.0∶1.4(g/mL)時，大豆致敏原降解率大大提高，并于1.0∶1.2(g/mL)處達到最高為92.43%。

2.1.4 發酵溫度對致敏原降解率的影響 當培養基初始pH為6.5，料水比為1.0∶1.2(g/mL)時，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個，于不同溫度的霉菌培養箱中發酵96h，考察不同發酵溫度對米曲霉降解大豆致敏原的影響，結果見圖4。

圖4 發酵溫度對米曲霉降解大豆致敏原的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

溫度一方面影響菌體自身的生長，影響蛋白酶的產生;另一方面也直接影響蛋白酶的活力。其過高和過低都會對蛋白酶的產生和活力不利。由圖4可知，不同發酵溫度下，大豆致敏原降解率呈現出明顯的變化。28～32℃這一溫度范圍，是最適合米曲霉生長和酶作用的，從而使大豆致敏原的降解率提高，30℃時可以達到最高為87.83%。

2.1.5 發酵時間對致敏原降解率的影響 當培養基初始pH為6.5，料水比為1.0∶1.2(g/mL)時，每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個，于30℃霉菌培養箱中發酵不同時間，考察不同發酵時間對米曲霉降解大豆致敏原的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨著發酵時間的延長，米曲霉及其蛋白酶對大豆致敏原的作用越來越充分，降解率不斷提高。發酵 120h，大豆致敏原的降解率達到89.99%，繼續延長發酵時間，降解率趨于平緩。

2.2 響應面實驗分析及結果

圖5 發酵時間對米曲霉降解大豆致敏原的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae

2.2.1 實驗設計及結果 根據Box－Behnken中心設計原理建立數學模型，以發酵溫度、料水比和培養基初始pH為自變量，以致敏原降解率為應變量，設計3因素3水平實驗，見表2;實驗結果見表3。

表2 響應面分析因素、編碼和水平表Table 2 Factors coding and levels in response surface design

根據表3進行米曲霉固態發酵豆粕實驗，共實施17次，其中1～12為析因實驗，13～17為中心點實驗，用來估計實驗誤差。對表3中Y(致敏原降解率)及3個因素 X1(料水比)、X2(發酵溫度)和 X3(培養基初始pH)進行回歸分析。各個因素回歸擬合后，得致敏原降解率對料水比、溫度和pH的二次多項式回歸方程:

表3 Box－Behnken實驗設計表及結果Table 3 Box－Behnken experimental design and results

2.2.2 響應面分析及最優降解條件的確定 在α=0.05顯著水平上，回歸方程方差分析顯著性檢驗結果表明(表4)，失擬項p＞0.05，不顯著;模型決定系數R2=0.9964，回歸模型p＜0.0001，高度顯著，說明回歸方程的擬合程度較好，實驗誤差小，預測值和實測值之間具有高度的相關性，可以用于米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的理論預測。

表4 響應面回歸模型方差分析結果Table 4 Results of variance analysis for created regression equation

回歸模型系數顯著性檢驗結果顯示:料水比(X1)、發酵溫度(X2)和培養基初始pH(X3)對致敏原降解率有顯著的影響。從p值和系數估計大小來看，X3＞X2＞X1，即對抗原性降低的影響因素大小順序為培養基初始pH＞發酵溫度＞料水比。二次項和對抗原性的降低都有顯著的影響。交互作用項除X1X2對致敏原降解率顯著外，其他X1X3和X2X3對致敏原降解率均不顯著。

根據實驗因素的顯著性分析結果，得到該實驗優化后的回歸模型為:

根據回歸方程利用Design－Expert繪制響應面分析圖，如圖6所示。

從響應面的最高點可以看出，在所選的范圍內存在極值點。同樣從各個響應面圖中也可以看出，這三個因素之間都存在著一定的交互作用。其中料水比和發酵溫度的交互作用最為顯著，表現出了與方差分析一致的結果。

2.2.3 驗證實驗 為了求得米曲霉固態發酵降低大豆抗原蛋白抗原性的最佳條件，對所得的回歸擬合方程分別對各自的變量求一階偏導數，并令其為0，得到三元一次方程組，求解此方程可以得到模型的極值點，即當料水比為1∶1.21、發酵溫度為29.8℃、培養基初始pH為6.63時，理論最大降低率為99.15%。

為了檢驗米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原模型的有效性，進行了驗證實驗。選取料水比為1∶1.21(g/mL)、發酵溫度 29.8℃、培養基初始 pH 為6.63、接種量為每10g豆粕接入米曲霉孢子1×108個、發酵時間120h，實驗重復3次，致敏原降解率分別為99.10%、99.06%、98.91%，平均值為99.02%，與模型的預測值99.15%誤差為0.13%，可以看出此模型能夠較好地反映出米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的條件。

圖6 溫度和料水比、初始pH和料水比、初始pH和溫度對米曲霉固態發酵降解大豆致敏原影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot of effect of tempreture and ratio of material to water，initial pH and ratio of material to water，initial pH and tempreture on the soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae solid fermentation

3 結論

3.1 根據Box－Behnken中心設計原理，建立米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原模型，以料液比(X1)、發酵溫度(X2)、培養基初始pH(X3)為自變量，以致敏原降解率(Y)為應變量，在α=0.05顯著水平上，優化回歸模型為:自變量影響致敏原降解率大小順序為:培養基初始 pH＞發酵溫度 ＞料水比。

3.2 由響應面數據得出米曲霉固態發酵豆粕降解大豆致敏原的最佳條件為:料水比為1∶1.21(g/mL)、發酵溫度29.8℃、培養基初始pH為6.63。在此發酵條件下預測的大豆蛋白致敏原降解率為99.15%，實驗平均值為99.02%。

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Optimization of conditions for soybean allergens degradation by Aspergillus oryzae solid fermentation

HUANG Ying1，QIAN He1，*，WANG He－ya1，ZHANG Wei－guo2，BI Jing－hui1
(1.School of Food Scicence and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

To reduce or even remove the immunoreactivity of solid－state fermented soybean meal by Aspergillus oryzae，the condition of solid －state fermentation was optimized by response surface method.The principal fermentation factors，including ratio of material to water，temperature and medium initial pH were screened from the factors of time，inoculum size，temperature，initial pH and water content by single factor analysis.After that，the optimum fermentation conditions for soybean allergens degradation was comfirmed by Box－Behnken experimental design.And the results showed that under the condition ratio of material to water 1∶1.21(g/mL)，fermentation temperature 29.8℃，pH 6.63，the theoretically lowest allergens degradation rate of 99.15%could be achieved.And the final experimental value of degradation rate was 99.02%，the difference between theoretical value and experimental value was 0.13%，which indicated that the model could be used to predict the experimental value accurately.

soybean allergens;degradation;Aspergillus oryzae;solid－fermentation;response surface method

TS201.3

A

1002－0306(2012)17－0142－05

2012－02－29 *通訊聯系人

黃穎(1988－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品安全與質量控制。

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAK10B03)。