海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶制備及酶學性質的研究

王勝男，江連洲，2，* ，李 楊，2，李丹丹，王中江，齊寶坤，劉 琪，王 梅

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶制備及酶學性質的研究

王勝男1，江連洲1，2，*，李 楊1，2，李丹丹1，王中江1，齊寶坤1，劉 琪1，王 梅1

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

對采用海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶的方法和酶學性質進行了研究。在單因素實驗基礎上，采用響應面優化方法確定固定化的最優條件，得到的最佳條件為:海藻酸鈉濃度3.1%，pH9.4，CaCl2濃度3.0%，游離酶添加量10000U/g，時間1.8h，固定化酶活力可達5518U/g。固定化酶的最適pH為10，最適溫度為60℃，制得的固定化酶的熱力學穩定性和操作穩定性較好。此外，固定化酶重復利用5個循環后酶活力僅降低40%。

海藻酸鈉，堿性蛋白酶，固定化酶，酶學性質

目前，酶固定化技術已在食品工業、醫藥、化工等領域廣泛應用，隨著人們對天然高分子載體的不斷挖掘和探究，對其進行改性，或利用超臨界技術、納米技術、膜技術等來固定化酶，同時，開發新型、高效固定化酶反應器，進一步提高轉化和生產能力是固定化酶技術發展的趨勢［1－4］。堿性蛋白酶是一類適宜在堿性條件下水解蛋白肽鍵的酶類，隨著人們對堿性蛋白酶認識的不斷深入，其被廣泛應用在水解植物蛋白中，但是酶穩定性較差，在溫度、pH和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活，酶與底物和產物混在一起，反應結束后，難以回收利用，而且難于實現連續化酶反應。酶反應后與產物混在一起，無疑給產物的進一步分離純化帶來一定的困難。固定化酶相比于游離酶穩定性有較大提高，對熱、pH等的穩定性提高，對抑制劑的敏感性降低，易于分離，改善了后處理過程［5］。反應完成后經過簡單的過濾或離心，產物即可與酶蛋白或細胞達到有效分離。固定化體系適合于連續化、自動化生產，酶催化過程有利于控制，固定化酶經回收可反復使用，提高了酶的利用效率，降低了生產成本［6－8］。本研究采用海藻酸鈉作為固定化載體，海藻酸鈣凝膠是容易獲得，已經被證實可以用于多種反應和許多種酶，同時對固定化堿性蛋白酶制備適宜條件進行了系統研究，為堿性蛋白酶固定化研究提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Alcalase堿性內切蛋白酶(1.2×105U/mL) 德國Novo公司;海藻酸鈉 食品級，上海化學試劑站分裝廠;福林酚、酪蛋白 分析純，Sigma公司;戊二醛、三氯乙酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、四硼酸鈉、無水乙醇 分析純，天津迪博化工股份有限公司。

FA2004型電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;WGL－45B型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;LDZ5－2型臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠;pHS－3C型酸度計 上海雷磁儀器廠;UV759CRT型紫外可見分光光度計 上海佑科儀器公司;XMTD－4000型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;78－1磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶 稱取一定質量的海藻酸鈉，配制成不同質量分數的海藻酸鈉溶液，并加熱溶解。量取一定量的堿性蛋白酶，并用硼酸緩沖液稀釋。將一定質量分數的海藻酸鈉溶液按一定比例與堿性蛋白酶混合，充分攪拌均勻后，用蠕動泵將混合液以5cm高度滴入一定質量分數的CaCl2中形成凝膠珠，放入4℃冰箱中進一步硬化一段時間。得到顆粒均勻、形狀規整的海藻酸鈉微球。去離子水洗滌數次后，確定上清液中無酶。取出抽濾，同時測其酶活，剩余的于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 單因素實驗 海藻酸鈉質量分數3%，pH9.5，CaCl2質量分數3%，游離酶添加量10000U/g，固定化時間2h?？刂?因素不變，變化1個因素，海藻酸鈉質量分數1.5%～4%，pH7～12硼酸緩沖液，CaCl2質量分數2%～4%，游離酶添加量4000～20000U/g，固定化時間1～3h來確定各因素對固定化效果的影響。

1.2.3 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應面中心組合實驗設計，研究各固定化影響因素對固定化酶活力回收率的影響規律，并得到固定化堿性蛋白酶的最佳條件。以各固定化影響因素海藻酸鈉濃度(x1)、pH(x2)、CaCl2濃度(x3)、游離酶添加量(x4)、時間(x5)為自變量，以固定化酶活力回收率響應值，其因素水平編碼表見表1。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 酶活力的測定 堿性蛋白酶酶活力測定采用標準SB/T13017－1999，即福林—酚法測定堿性蛋白酶酶活，固定化酶活力單位為U/g。

相對酶活力，以酶活力最大值為100%，其余數值與其對比，即相對酶活力，以百分數表示。

1.2.5 固定化酶和游離酶的酶學性質 用pH7～12硼酸－氫氧化鈉緩沖液鑒定pH對游離酶和固定化酶活力的影響。使溫度在30～80℃之間變化，測定溫度對堿性蛋白酶酶活的影響。在40、60、80℃下，處理30min～3h測定游離酶和固定化酶的熱力學穩定性。

1.2.6 固定化酶的操作穩定性 在60℃，攪拌速度150r/min，0.5%酪蛋白的條件下，連續循環操作使酶的活力下降，以測量固定化酶的操作穩定性。每循環30min用去離子水洗固定化粒子。

1.3 數據處理

所有實驗數據均為“平均值±標準差”，n=3。采用SAS9.2統計分析軟件對實驗數據進行分析［6］。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線的繪制

按1.2.4福林—酚法，由測得數據繪制酪氨酸標準曲線，標準方程為 Y=0.0082X+0.0093，R2=0.9992。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 固定化條件的確定

2.2.1 海藻酸鈉對固定化效果的影響 從圖2可看出，海藻酸鈉濃度是影響海藻酸鈉成球的重要因素。當海藻酸鈉濃度低于3%時，微球表面形成的固定化膜強度不夠，容易分散、機械強度差，導致制備的海藻酸鈉微球有明顯的拖尾現象，且凝珠脆弱，易破壁，變化顯著(p＜0.05)。當海藻酸鈉濃度達到3%時，固定化酶的酶活力回收率最高，制備的海藻酸鈉微球呈圓形，機械性能較好。隨著海藻酸鈉濃度的進一步增加，溶液黏度增大，在相同擠壓孔徑下，擠壓越來越難，形成的微球表面結構致密，固定化膜強度過高，導致酶活力回收率下降［9］。當海藻酸鈉濃度達到3.5%后，濃度繼續增大到4%，變化不顯著(p＞0.05)。因此，本實驗選擇最佳的海藻酸鈉濃度為3%。

2.2.2 pH對固定化效果的影響 由圖3可知，當pH低于9.5時，酶活力回收率較低，隨著pH逐漸升高到9.5時，酶活力回收率最高，當pH繼續增大時，酶活力回收率顯著下降(p＜0.05)?？梢妏H對固定化酶活力具有較大影響，可能由于酶表面特性基團的電離作用使得蛋白酶分子在不同pH時以不同的解離狀態存在，影響了酶與載體的結合能力［10］，從而影響酶的活力，產生了圖3中所示的結果。

圖2 海藻酸鈉對堿性蛋白酶固定化效果的影響Fig.2 Effects of sodium alginate concentration on immobilization of alkaline protease

圖3 pH對堿性蛋白酶固定化效果的影響Fig.3 Effects of pH value on immobilization of alkaline protease

2.2.3 CaCl2濃度對固定化效果的影響 CaCl2與海藻酸鈉反應形成海藻酸鈣凝膠是固定化酶的重要過程，CaCl2質量分數對形成凝膠的機械強度有重要影響。從圖4中可以看出，當CaCl2質量分數低于3%時，凝膠的機械強度差，固定化酶活力回收率低，變化顯著(p＜0.05)。當CaCl2質量分數高于3%時，可能由于Ca離子布滿凝膠表面［11］，影響了酶的作用效果，隨著CaCl2濃度的增大而顯著降低(p＜0.05)。當CaCl2質量分數為3%時，固定化酶活力回收率最大，因此CaCl2濃度選擇3%。

圖4 CaCl2濃度對堿性蛋白酶固定化效果的影響Fig.4 Effects of CaCl2concentration on immobilization of alkaline protease

2.2.4 游離酶添加量對固定化效果的影響 圖5中顯示，加酶量在2000～10000U/g范圍內，固定化酶酶活力隨著加酶量的增加而增加，由于此時載體上的蛋白質結合點未達到飽和，而固定化率的趨勢顯著上升(p＜0.05)。當加酶量繼續增加，在10000～18000U/g范圍內，固定化率隨加酶量的增加而降低，原因在于酶量增加到一定程度時，載體上蛋白結合點達到飽和，酶分子繼續增多，使酶分子相互聚集，造成酶活性中心結構發生變化［12］，因此固定化酶活力也略有下降(p＞0.05)。綜合考慮固定化酶活力和酶活力回收率，確定給酶量為10000U/g。

圖5 游離酶添加量對堿性蛋白酶固定化效果的影響Fig.5 Effects of enzyme amount on immobilization of alkaline protease

2.2.5 時間對固定化效果的影響 海藻酸鈉與CaCl2形成凝膠是Ca2+從海藻酸鈉中置換Na+形成的，置換效果與時間有密切關系。從圖6中可看出，固定化時間在1～2h范圍內，固定化酶活力回收率隨著時間的延長而顯著增加(p＜0.05)，但時間超過2h后，固定化酶活力回收率逐漸降低，原因在于固定化時間過長，海藻酸鈣結構過于致密，底物的擴散阻力增加［13］，同時已固定化的酶也可由內向外擴散，造成酶的泄露。因此，確定最佳固定化時間2h。

圖6 時間對堿性蛋白酶固定化效果的影響Fig.6 Effects of time on immobilization of alkaline protease

2.3 固定化條件的優化

響應面實驗方案及結果見表2。實驗號1～26為析因實驗，27～36為10個中心實驗，用以估計實驗誤差。

通過統計分析軟件SAS9.2進行數據分析，建立二次響應面回歸模型為:

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，響應曲面數據的方差分析結果見表3。由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.001)，失擬項不顯著，并且R2=96.18%=91.08%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，實驗誤差小，可以用此模型來分析和預測結果。由此可以認為上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗可以得到因子貢獻率為:x1＞x4＞x3＞x2＞x5，即海藻酸鈉濃度＞游離酶添加量＞CaCl2濃度＞pH＞時間。

表2 響應面實驗方案及結果Table 2 Design and result of response surface analysis

表3 回歸與方差分析結果Table 3 Results of regression and variance analysis

續表

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果見表4，由表4可知當海藻酸鈉濃度為3.1%，pH為9.4，CaCl2濃度為3.0%，游離酶添加量為10000U/g，時間為1.8h，響應面最優值為(54.95±1.08)%，同時測得最優條件下，固定化酶活力可達5518U/g。

表4 響應面分析法尋優結果Table 4 Results of response surface optimization

各兩因素交互作用(顯著項)對蛋白提取率影響的響應面圖見圖7。

2.4 驗證實驗

在響應面分析法求得的最佳條件下，即海藻酸鈉濃度為3.13%，pH為9.40，CaCl2濃度為3.04%，游離酶添加量10000U/g，進行平行實驗(3次)，3次平行實驗的平均值為55.01%。響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預測實際固定化效果。

2.5 固定化堿性蛋白酶酶學性質

2.5.1 最適pH 在不同pH的硼酸－氫氧化鈉緩沖液中測定游離酶和固定化酶活力，并計算相對酶活力，結果見圖8。從圖中可以看出，固定化酶的最適pH為10，較游離酶的最適pH9向堿性方向移動一個單位，同時在極限pH處，固定化酶的相對酶活力比游離酶高，原因可能是由于載體的存在影響了固定化酶的結構，載體對離子產生一定阻礙作用［14］。

2.5.2 最適溫度 在不同溫度下測定游離酶和固定化酶的酶活力，結果如圖9所示。從圖中可知，游離酶的最適溫度為50℃，固定化酶為60℃，但由于過熱使部分酶失活，高于60℃酶活顯著降低(p＜0.05)，結果表明酶經固定化后最適溫度有所提高，可能由于固定化過程中酶的結構發生了變化，同時載體對酶也有一定保護作用［15］。

圖7 各兩因素交互作用(顯著項)對固定化效果影響的響應面圖Fig.7 Response surface analysis of significant effective interaction items of different parameters on immobilization of alkaline protease

圖8 不同pH時游離酶和固定化酶的相對酶活力Fig.8 Relative activity of free and immobilized alkaline protease under different pH value conditions

圖9 不同溫度時游離酶和固定化酶的相對酶活力Fig.9 Relative activity of free and immobilized alkaline protease under different temperatures

2.5.3 熱力學穩定性 從圖10中可以看出，固定化酶相比游離酶有著較強的熱力學穩定性。固定化酶經40℃處理180min，酶活保持原來的80%，而游離酶酶活損失了近50%。60℃處理時，游離酶的穩定性也不及固定化酶。80℃處理時，游離酶處理90min時，基本喪失酶活，而固定化酶直至120min才喪失酶活。這種現象的產生，可能是由于載體提供了一種微環境，對酶起到了保護作用，同時固定化酶要比游離酶的結構穩定［16］。

圖10 固定化酶與游離酶的熱力學穩定性Fig.10 Thermal stability of immobilized alkaline protease and free

2.5.4 操作穩定性 測定循環使用固定化酶的酶活力，以測定固定化酶的操作穩定性。從圖11中可以看出，隨著循環次數的增加，相對酶活力降低。造成酶活力損失的原因可能是，載體受到磨損，酶從海藻酸鈉載體上脫落，或是酶的作用位點隨著水解酪蛋白的不斷進行而逐漸暴露，容易遭到破壞。實驗結果表示，固定化酶循環使用5次后，酶活力仍可保持原來的60%。

3 結論

圖11 固定化酶的操作穩定性Fig.11 Operation stability of immobilize alkali protease

本實驗提供了一種在海藻酸鈉上固定堿性蛋白酶的簡單方法，海藻酸鈉是一種低成本、無毒、易于獲得的載體，固定化酶與游離酶同樣可以為酶解反應提供最適條件。本實驗得到了固定化的最佳條件，海藻酸鈉濃度為3.1%，pH為9.40，CaCl2濃度為3%，游離酶添加量10000U/g，時間1.8h，固定化酶活力可達5518 U/g，同時測定了制得的固定化酶的最適溫度和pH分別為60℃和10，同時固定化酶的熱力學穩定性和操作穩定性較好。固定化酶循環利用5次，酶活仍可保持原來的60%。本實驗為固定化酶在實際生產中應用提供了理論支持，在實際生產中的生產率有待進一步研究。

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Preparation and enzymatic properties of alkaline protease immobilized with sodium alginate

WANG Sheng－nan1，JIANG Lian－zhou1，2，*，LI Yang1，2，LI Dan－dan1，WANG Zhong－jiang1，QI Bao－kun1，LIU Qi1，WANG Mei1
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

Preparation and enzymatic properties of alkaline protease immobilized with sodium alginate were studied.Based on single factor experiments，response surface optimization method was used to determine the optimal conditions for immobilization.The results showed that optimum conditions were:concentration of sodium alginate 3.1%，concentration of CaCl23.0%，pH 9.4，amount of free enzyme 10000U/g，time 1.8h，enzyme activity up to 5518U/g.The optimum pH was 10，optimum temperature was 60℃，the thermal stability and operational stability of the immobilized enzyme was better.Furthermore，the enzyme activity of immobilized enzyme was only reduced by 40%after used five cycles.

sodium alginate;alkaline protease;immobilized enzyme;enzymatic properties

Q814.2

A

1002－0306(2012)17－0166－06

2012－02－02 *通訊聯系人

王勝男(1988－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

黑龍江省攻關項目(GA09B401－6);農業部現代農業產業技術體系建設項目(nycytx－004)。