脲基酰胺酶基因在黃酒酵母中的整合型表達

朱旭亞，陸 健，謝廣發

(1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122;2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122;3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122;4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000)

脲基酰胺酶基因在黃酒酵母中的整合型表達

朱旭亞1，2，3，陸 健1，2，3，謝廣發3，4，*

(1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122;2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122;3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122;4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000)

氨基甲酸乙酯是一種人類的潛在致癌物，在許多發酵酒中均有存在，主要來源于發酵過程中酵母代謝產生的尿素。以pYX212為載體，將脲基酰胺酶基因DUR1，2克隆到TPI強啟動子和終止子之間的位點，再通過同源重組的方式將受強啟動子調控的目的基因整合到黃酒酵母的基因組中，最終獲得一株低產尿素的胞內脲基酰胺酶基因組成型高表達的黃酒酵母85#DUR1，2。在實驗室規模的黃酒釀造實驗中，85#DUR1，2產尿素量為8.34mg/L，比出發菌株降低了69.9%，貯存一段時間后的酒液中氨基甲酸乙酯含量比出發菌株降低了40.5%，而發酵性能、酒精度、總酸及氨基態氮與出發菌株無顯著差異。

氨基甲酸乙酯，尿素，黃酒，脲基酰胺酶基因，酵母

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)是一種人類潛在的致癌物，在發酵食品和酒精飲料中廣泛存在［1］。目前，EC的檢測主要用的是 GC/MS法，通過此法檢測表明，在白蘭地、威士忌、中國黃酒、日本清酒和葡萄酒中，EC 含量較高［1－2］。因此，許多國家已針對葡萄酒、清酒、白蘭地、威士忌等酒種制定了相應的EC限量標準，對黃酒中EC含量的控制已迫在眉睫［3－4］。黃酒中90%的氨基甲酸乙酯由尿素和乙醇反應生成，而尿素主要是在發酵過程中由酵母代謝產生［5］。酵母通過精氨酸酶(CAR1基因編碼)分解精氨酸產生尿素，再通過脲基酰胺酶(DUR1，2基因編碼)將尿素分解成氨和二氧化碳。研究表明，釀酒酵母在生長繁殖和進行酒精發酵時存在氮源代謝阻遏(nitrogen catabolite repression，簡稱 NCR)機制，即酵母會優先利用氨，當氨利用完全后才利用尿素作為氮源［6］。因此，在酒精發酵階段，精氨酸大量水解成尿素，DUR1，2基因由于受到NCR作用，表達水平遠低于CAR1，多余尿素不能被及時分解，隨即被轉運出細胞，使發酵液中的尿素含量大幅增加［7－9］，最終導致黃酒中形成較高量的EC。使用低產尿素的黃酒酵母可以有效地解決黃酒中EC含量過高的問題。目前，國外已有對葡萄酒酵母和清酒酵母進行低產尿素功能改造的相關報道，其中通過組成型高表達脲基酰胺酶基因進行酵母工程菌的構建被認為是最優策略。通過這種手段構建的葡萄酒酵母 522DUR1，2獲 得 美 國 FDA 的 GRAS(Generally Regarded As Safe)認證，實現了商業化［10］。本研究以黃酒生產常用的酵母菌株85#為實驗對象，將其脲基酰胺酶基因DUR1，2進行克隆，并通過同源重組整合到基因組中，考察獲得的代謝工程菌低產尿素效果，以期為解決黃酒EC含量偏高問題提供一種有效的參考思路和方法。

表1 實驗用的主要引物Table 1 Primers used in the experiment

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌E.coli JM109 實驗室保存;黃酒酵母85# 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司;質粒pPICZα 實驗室保存;質粒pYX212 由江南大學生物工程學院周景文博士提供;LB培養基 0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉，使用前加入氨芐青霉素(工作濃度為50μg/mL)或博來霉素(即Zeocin抗生素，工作濃度為50μg/mL)，固體培養基在液體培養基中加入2%瓊脂;YPD培養基 1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，使用前加入Zeocin抗生素(工作濃度為300μg/mL)，固體培養基在液體培養基中加入2%瓊脂;尿素培養基 0.17%YNB(酵母無氨基氮源)、2%葡萄糖、0.1%尿素;限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、Prime Star DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒等 Takara公司;質粒小量提取試劑盒 上海生工公司;酵母基因組提取試劑盒 北京三博遠志生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物的設計 根據已知的DUR1，2基因、Sh ble基因及pYX212質粒的序列，設計相應的PCR引物進行基因的擴增或重組子的鑒定，列于表1，引物由上海賽百盛公司合成。

1.2.2 表達載體pYX212－DUR1，2的構建 參照《分子克隆實驗指南(第三版)》［11］，進行相關的分子操作，構建含有脲基酰胺酶基因編碼框的重組表達質粒pYX212－DUR1，2。構建的質粒送Takara公司測序鑒定。

1.2.3 共轉質粒pYX212－Sh ble的構建 參照《分子克隆實驗指南(第三版)》［11］，構建含抗生素標記的選擇載體 pYX212－Sh ble。

1.2.4 黃酒酵母的轉化 參照文獻［12］，采用醋酸鋰法，將表達載體pYX212－DUR1，2線性化后與質粒pYX212－Sh ble共轉化黃酒酵母85#。

1.2.5 酵母陽性轉化子的篩選、鑒定 隨機挑取平板上的轉化子，先用引物P5/P6進行PCR鑒定，以確定目的基因是否進入酵母細胞。對于陽性結果的轉化子進行劃線轉接，再用試劑盒提取其基因組，以此為模板，P5/P2為引物進行PCR擴增，二次鑒定，驗證目的基因整合位點是否正確。

1.2.6 尿素消耗實驗 將經PCR鑒定獲得的陽性轉化子和初始菌株分別接種于YPD液體培養基中，30℃培養20h，分別取等量培養液以1∶100的比例轉接到尿素培養基中，30℃振蕩培養。24h后分別取1mL培養液，測定其中尿素的含量。此實驗可快速檢測酵母轉化菌株分解尿素的能力，以對酵母陽性轉化子進一步鑒定，驗證其低產尿素效果。

1.2.7 黃酒發酵實驗 分別采用獲得的改造菌株與初始菌株進行黃酒的小試發酵，方法為:稱取100g大米，浸米、蒸飯，攤飯冷卻，加麥曲和水拌飯，添加量為:麥曲15g、水170g，然后再加適量糖化酶，按照10%接種量接入黃酒酵母，30℃主酵4d，15℃后酵15d，每個菌株做三次重復。對于發酵獲得的酒液，煎酒過濾后于4℃貯存，并進行相關指標的測定。總糖、總酸、酒精度、氨基態氮按照黃酒國標(GB/T 13662－2008)進行測定，尿素參照相關文獻［13］，采用比色法進行測定，EC 采用 GC－MS 測定［14］。

1.2.8 遺傳穩定性實驗 將獲得的黃酒酵母工程菌進行實驗室規模的發酵實驗，連續傳代發酵5次，考察其低產尿素遺傳性狀的穩定性。

2 結果與分析

2.1 表達載體pYX212－DUR1，2的篩選及鑒定

從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取大腸桿菌轉化子，以其為模板，以P1/P2為引物進行快速菌落PCR鑒定，再以鑒定陽性的單菌落進行質粒抽提，酶切驗證。結果如圖1，用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切重組質粒后，得到了兩個片段，分別約5.5kb和8.3kb，大小與目的基因及空載體酶切后大小一致，證明目的基因片段插入正確。測序結果與GeneBank中報道的序列進行比對，DUR1，2基因編碼框內第532位堿基由T變為C，但編碼的氨基酸序列不變，因此符合要求。將獲得的重組質粒命名為pYX212－DUR1，2。

2.2 共轉質粒pYX212－Sh ble的篩選及鑒定

圖1 重組質粒pYX212－DUR1，2的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切驗證Fig.1 The restriction analysis of plasmid pYX212－DUR1，2 by EcoRⅠ/BamHⅠ

從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取大腸桿菌轉化子，以其為模板，以P3/P4為引物進行快速菌落PCR鑒定，再用陽性轉化子的單菌落，提質粒酶切驗證。如圖2，EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切重組質粒后獲得了約0.4kb和8.3kb的兩個片段，與Sh ble基因和pYX212質粒雙酶切后的片段大小相符，證明Sh ble基因已正確插入質粒pYX212內部。

圖2 重組質粒pYX212－Sh ble的EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切驗證Fig.2 The restriction analysis of plasmid pYX212－sh ble by EcoRⅠ/HindⅢ

2.3 酵母轉化及轉化子的篩選、鑒定

將重組質粒 pYX212－DUR1，2用 BglⅡ線性化后，與共轉質粒pYX212－Sh ble共轉黃酒酵母85#，使目的基因通過同源重組整合到酵母的基因組中，如圖3。

圖3 重組黃酒酵母85#DUR1，2的構建Fig.3 Construction of recombinant yeast 85#DUR1，2

在含Zeocin抗生素的YPD平板上挑取酵母轉化子，以P5/P6為引物進行快速菌落PCR鑒定，發現較多轉化子能擴增出771bp的目標條帶，初步斷定目的基因轉入酵母胞內(見圖4A)。以這些酵母轉化子的基因組作為模板，以P5/P2為引物進行二次PCR驗證，獲得1株轉化子可擴增出目標條帶(TPI啟動子－DUR1，2編碼框區域)，將這株酵母轉化子命名為 85#DUR1，2(見圖 4B)。

圖4 酵母轉化子的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of yeast transformants

2.4 尿素消耗實驗結果

將 85#、85#DUR1，2同時進行尿素消耗實驗，進一步驗證二次PCR鑒定獲得的菌株是否符合要求，結果發現85#DUR1，2菌株分解尿素的能力明顯高于85#菌株(見圖5)，證明其脲基酰胺酶基因得到高表達。

圖5 工程菌株與出發菌株24h尿素消耗對比Fig.5 The comparison of urea degradation in 24 hours between the engineering and parental strains

2.5 黃酒發酵結果

對發酵后的黃酒進行相關指標的測定，結果如表2。從表2可以看出，與出發菌株相比，改造菌株釀造的黃酒在總糖、酒精度、總酸和氨基態氮方面沒有明顯的差異，而尿素和EC含量卻顯著降低，分別比出發菌株降低了69.9%和40.5%，說明改造菌株在不改變出發菌株發酵性能的前提下，能顯著降低其產尿素的能力，對降低黃酒中EC的含量具有較好的效果。

2.6 遺傳穩定性實驗

對獲得的黃酒酵母工程菌85#DUR1，2進行了連續5次的傳代發酵，測定每代酵母產尿素情況，發現5代酵母工程菌株與0代酵母工程菌株的產尿素含量均在8.21～9.08mg/L之間，無明顯變化，證明該菌株有較好的遺傳穩定性。

3 結論

本研究通過組成型高表達脲基酰胺酶基因，構建了一株低產尿素且遺傳穩定的黃酒酵母代謝工程菌。與出發菌株相比，其尿素產量降低了69.9%，釀造的酒液貯存一段時間后，EC含量降低了40.5%，而其他發酵指標基本不變。

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Constitutive expression of DUR1，2 gene in Chinese rice wine yeast

ZHU Xu－ya1，2，3，LU Jian1，2，3，XIE Guang－fa3，4，*
(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;4.Zhejiang Guyue Longshan Shaoxing Wine Co.，Ltd.Shaoxing 312000，China)

Ethyl carbamate(EC)is a potential carcinogen for human，which can be found in many fermented alcoholic beverages.The main precursor for EC is urea produced by yeast.The DUR1，2 gene which encoded urea amidolyase was cloned into plasmid pYX212 between the TPI promoter and terminator sites to form the DUR1，2 expression cassette.The cassette was then integrated into the genome of the Chinese rice wine yeast 85#.Thus a urea－ degrading Chinese rice wine yeast 85#DUR1，2was obtained.According to the laboratory scale rice wine brewing tests，urea was reduced to 8.34mg/L by yeast 85#DUR1，2，69.9%less than the parental strain，while the ethyl carbamate level was 40.5%less than that of the parental strain after a period of storage.Meanwhile，85#DUR1，2was substantially equivalent to its parental strain in terms of fermentation ability，ethanol，total acid and amino nitrogen.

ethyl carbamate;urea;Chinese rice wine;DUR1，2 gene;yeast

Q786

A

1002－0306(2012)17－0173－04

2011－12－28 *通訊聯系人

朱旭亞(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:發酵工程。

紹興市科技計劃項目(2009A21025)。