高溫米糠粕堿不溶蛋白的酶法提取

馬永強，殷嘉音，周雪松，張 娜，王 雪，楊 楠

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；3.黑龍江省北大荒米業集團有限公司，黑龍江 哈爾濱 150036)

高溫米糠粕堿不溶蛋白的酶法提取

馬永強1,2，殷嘉音1,2，周雪松3，張 娜1,2，王 雪1,2，楊 楠1,2

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；3.黑龍江省北大荒米業集團有限公司，黑龍江 哈爾濱 150036)

以高溫米糠粕為基礎原料，通過酶解能力比較，確定堿性蛋白酶對高溫米糠粕中堿不溶性蛋白的作用效果最佳。通過單因素試驗分析酶添加量、作用溫度、pH值和酶解時間對蛋白提取效果的影響。通過正交試驗確定最佳提取工藝：堿性蛋白酶添加量300U/g、提取溫度55℃、pH8.5，蛋白提取率可達28.9%。

高溫米糠粕；堿性蛋白酶；蛋白提取率；堿提法

米糠是水稻制米過程中產生的副產物，其中富含蛋白質、脂肪、維生素、纖維素等，米糠中營養物質的含量幾乎占大米營養價值的60%。我國水稻播種面積大、產量高，總產量在1.8～2億噸左右，占全國糧食總產量的42%，占世界稻谷總產量的35%左右[1-2]。目前我國米糠資源擁有量在1000萬噸左右，資源十分豐富，是一種量大面廣的可再生資源[3]。

米糠中的蛋白是一種優質蛋白，與酪蛋白、大豆分離蛋白中氨基酸組成相比，米糠蛋白中氨基酸能很好滿足2～5歲兒童對氨基酸的需要[4]，其氨基酸組成更接近FAO/WHO推薦模式[5]。姚惠源等[6]對米糠蛋白進行了系統的研究，指出米糠中清蛋白占34%～40%，球蛋白占33%～39%，醇溶蛋白占3%～8%和谷蛋白占19～25%。但是具體化到我國米糠加工利用的實際情況，卻與上述研究結論存在較大的偏差。為了防止米糠中的油脂氧化酸敗，米糠都經過了熱穩定化處理，尤其是在我國現行制米工藝和米糠油生產工藝中，米糠(粕)中的蛋白相當部分發生了變性后的凝聚過程，實際的可溶蛋白比例大大低于上述結論。米糠蛋白的提取方法主要包括：堿法提取[7]、蛋白酶法[8]、非蛋白酶法[9]、多聚糖沉淀法[10]和亞臨界水提取法[11]等。其中，堿法提取是公認的提取工藝簡便、提取率較高的方法[12]。但是對于經熱穩定化浸提米糠油的糠粕，堿法的提取效率也大打折扣，所以考慮對米糠進行不同提取技術的復合處理就非常必要了。

本研究針對高溫米糠粕中的高變性蛋白，將不同的蛋白酶作用于其中的堿不溶性蛋白，確定蛋白酶對高變性并發生部分凝聚的蛋白的水解能力，為蛋白酶法提取米糠蛋白的工藝研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫米糠粕 黑龍江北大荒米業有限公司；堿性蛋白酶 天津利華酶制劑有限公司；中性蛋白酶(400U/g)無錫酶制劑有限責任公司；復合蛋白酶(500U/g)、風味蛋白酶(550U/g) 諾和諾德(天津)生物技術有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純) 哈爾濱市新春化工廠；鹽酸(化學純) 哈爾濱市新達化工廠；氫氧化鈉(化學純) 天津市大陸化學試劑廠；甲基紅(分析純)、亞甲基藍(分析純) 天津市化學試劑六廠。

1.2 儀器與設備

TGL-16G-B臺式高速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；HYP-1008消化爐 上海纖檢儀器有限公司；W201B恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠；中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；H198/28型pH計測試筆 北京海星順達公司；BS224S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；HNY-100B恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高溫米糠粕的基礎成分分析

水分含量的測定：GB5009.3—2010《食品中水分的測定》；總蛋白及可溶蛋白含量測定：GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法；脂肪含量的測定：GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；總糖含量的測定：GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》；纖維含量的測定：GB/T 9822—1988《谷物不溶性膳食纖維測定法》；植酸含量的測定：GB/T 5009.153—2003《植物性食品中植酸的測定》；灰分含量的測定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.3.2 高溫米糠粕蛋白的堿法提取工藝流程

高溫米糠粕→稱取原料→加入一定量的氫氧化鈉溶液→在不同溫度下提取一定時間→離心分離(4500r/min，15min) →收集上清液→用凱氏定氮法對清液和下沉物進行蛋白含量測定

1.3.3 堿不溶蛋白的蛋白酶法提取

1.3.3.1 蛋白酶的選擇

選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶和風味蛋白酶4種蛋白酶，分別在該酶最優反應條件下提取高溫粕中的蛋白質，以蛋白質提取率為指標確定作用效果最佳的酶。

1.3.3.2 堿性蛋白酶酶解單因素試驗

1) 堿性蛋白酶添加量對酶解效果的影響

分別準確稱取5份1.3.2節中的下沉物各10g，調節pH8，提取溫度55℃，然后分別在堿性蛋白酶添加量為100、200、300、400、500U/g的條件下提取3h，然后4500r/min離心15min，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量。

2) 溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響

分別準確稱取5份1.3.2節中的下沉物各10g，調節pH8，添加堿性蛋白酶300U/g，然后分別在溫度45、50、55、60、65℃的條件下提取3h，然后4500r/min離心15min，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量。3) pH值對堿性蛋白酶酶解效果的影響

分別準確稱取5份1.3.2節中的下沉物各10g，添加堿性蛋白酶300U/g，提取溫度55℃，然后在pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0條件下提取3h，然后在4500r/min離心15min，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量。

4) 反應時間對堿性蛋白酶酶解效果的影響

分別準確稱取5份1.3.2節中的下沉物各10g，調節pH8，添加堿性蛋白酶300U/g，提取溫度55℃，然后分別提取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，然后在4500r/min離心15min，收集上清液，測定上清液中蛋白質含量。

1.3.3.3 堿性蛋白酶酶解正交試驗

在單因素試驗的基礎上進行L9(34)正交試驗，確定堿性蛋白酶對高變性米糠蛋白作用工藝條件，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design L9(34)

1.3.4 蛋白質提取率計算

2 結果與分析

2.1 高溫粕米糠基礎成分測定

表2 高溫粕米糠基礎成分Table 2 Proximate chemical composition of high temperature meal rice bran

2.2 高溫米糠粕蛋白的堿法提取

經實驗研究，堿法提取的蛋白提取率可達33.2%，下沉物中蛋白含量2.58g/100g濕基，下沉物水分含量74.2%。

2.3 蛋白酶的篩選

用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶在特定的條件下對米糠蛋白進行水解，測得蛋白質提取率見圖1。

圖1 不同蛋白酶對蛋白質提取率的影響Fig.1 Effect of different proteases on extraction rate of alkali insoluble protein

由圖1可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶4種酶在其最優作用條件的情況下提取高溫粕中的蛋白，堿性蛋白酶最用效果最好。由于堿性蛋白酶是內切酶，可以把大的蛋白質分子降解為小分子從而有利于蛋白質的溶出，堿性溶液環境可以更好的溶解堿溶性的谷蛋白，所以本實驗采用堿性蛋白酶來提取高溫粕中的蛋白質。另外，王文高等[13]曾分別用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合風味蛋白酶來提取蛋白質，經試驗得出堿性蛋白酶的作用效果最好，提取率最高。

2.4 堿性蛋白酶酶解單因素試驗

2.4.1 堿性蛋白酶添加量蛋白質提取率的影響

圖2 蛋白酶添加量對蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of alkaline protease dose on extraction rate of alkali insoluble protein

由圖2可得，蛋白質的提取率隨著蛋白酶添加量的增加而增多。但當蛋白酶添加量到達300～500U/g的時候，蛋白質提取率趨于平緩，所以300U/g為最優添加量。

2.4.2 溫度對蛋白質提取率的影響

圖3 溫度對蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of alkali insoluble protein

由圖3可知，當溫度在45～50℃的時候蛋白質提取率在隨著溫度的升高而增加，當溫度達到55℃時，蛋白質提取率達到最大為26.7%。溫度超過55℃時蛋白質提取率有所下降。酶的作用都有一個最適作用溫度，超過這個溫度，蛋白酶的活性降低。由此可知，蛋白酶作用最優溫度為55℃。

2.4.3 pH值對蛋白質提取率的影響

圖4 pH值對蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate of alkali insoluble protein

由圖4可知，蛋白質提取率隨著pH值的增加而升高，但當pH值超過8時，蛋白質提取率增加平穩，選pH8作為最優條件。由于堿性蛋白酶在堿性環境下有最適反應，所以溶液p H值越高，提取效果越好。

2.4.4 時間對蛋白質提取率的影響

圖5 時間對蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of alkali insoluble protein

由圖5可知，蛋白質提取率隨著溫度的增加而升高，但當溫度超過3 h時，蛋白質提取率增加平穩，在一定時間范圍內，蛋白酶能夠和蛋白質完全作用，反應已完成。繼續作用底物濃度將變小，產物濃度增加，會產生抑制作用，所以選酶解時間等于3h作為最優條件。

2.5 堿性蛋白酶正交試驗

表3 堿性蛋白酶提取蛋白質正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design protocol and corresponding results

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表3、4可知，各因素對蛋白質提取率影響的主次順序為A＞C＞B，即堿性蛋白酶添加量＞pH值＞溫度。其中堿性蛋白酶添加量、pH值比對實驗結果影響具有顯著性差異(P＜0.05)，提取溫度在一定范圍內對實驗結果影響不具有統計學意義(P＞0.05)。

實驗確定最佳提取條件為A2B2C3，即堿性蛋白酶添加量為300U/g、提取溫度為55℃、pH8.5。最高提取率為28.9%。王立等[14]研究了不同蛋白酶提取大米蛋白，實驗得出堿性蛋白酶作用效果最好，蛋白質的提取率高達80.03%。劉穎等[15]研究了不同蛋白酶提取米糠蛋白，得出結論堿性蛋白酶作用后的米糠蛋白的氮溶解指數有明顯的提高，可達到95.42%。本實驗的提取率有一定差距，原因主要是原料的不同，高溫粕的成分更加復雜，分子間結構互相連接更加緊密，使酶作用效果降低。

3 結 論

研究表明，高溫米糠粕中的可溶性蛋白比例較低，其NSI值僅為11.6%，屬高變性蛋白[16]。但其他研究者的報告中鮮有關于低變性米糠蛋白NSI值方面的內容，所以無法進行比較。對于這樣高變性并發生部分凝聚的米糠蛋白，在所選的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶和風味蛋白酶中，堿性蛋白酶對其的水解效果較為突出，這可能與弱堿性條件下，蛋白表面疏水性氨基酸殘基部分外翻，導致蛋白結構疏松有關。

通過單因素試驗和正交試驗優化，確定堿性蛋白酶對高變性米糠蛋白作用過程的影響程度依次序為堿性蛋白酶添加量＞pH值＞反應溫度。最佳酶解條件組合為堿性蛋白酶添加量300U/g、提取溫度55℃、pH8.5。在此條件下，蛋白的提取率可達28.9%。與其他研究者的報告相比較，本研究的提取率較低，但是因為其他研究者一般選用的實驗材料為低變性米糠，所以兩者之間的比較沒有參考意義。

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Enzymatic Extraction of Alkali Insoluble Protein from High Temperature Rice Bran Meal

MA Yong-qiang1,2，YIN Jia-yin1,2，ZHOU Xue-song3，ZHANG Na1,2，WANG Xue1,2，YANG Nan1,2
(1. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；3. Heilongjiang Beidahuang Rice Industry Group Co. Ltd., Harbin 150036, China)

The effectiveness of four different proteases in hydrolyzing high temperature rice bran meal for enzymatic extraction of alkali insoluble protein was compared to identify alkaline protease as the best choice. The effects of alkaline protease dose, temperature, pH and hydrolysis time on extraction efficiency were explored by one-factor-at-a-time design. Using orthogonal array design, the optimal conditions of alkaline protease dose, temperature, and pH were determined to be 300 U/g, 55 ℃, and 8.5, respectively. Under these conditions, the extraction yield of alkali insoluble protein was up to 28.9%.

high temperature rice bran meal；alkaline protease；protein extraction rate；alkali extraction

TS209

A

1002-6630(2012)18-0032-04

2012-04-10

黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目(2010td04)；哈爾濱市科技攻關計劃項目(2009AA6BN074)；黑龍江省科技廳科技攻關項目(GC12B403)

馬永強(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為農產品化學與綜合利用。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn