動(dòng)物尿液中沙丁胺醇?xì)埩艨焖贆z測(cè)

伍 季，尹紅娜*，竹 磊，呂 微

(1.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002)

動(dòng)物尿液中沙丁胺醇?xì)埩艨焖贆z測(cè)

伍 季1,2，尹紅娜2,*，竹 磊1，呂 微1

(1.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002)

探索一種動(dòng)物尿液樣品沙丁胺醇?xì)埩舻目焖贆z測(cè)方法。分別研究提取溶劑、β-環(huán)糊精與小分子醇的協(xié)同增敏作用和pH值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì)該方法的選擇性、線性方程、精密度和回收率以及檢出限進(jìn)行考察。結(jié)果表明：最佳提取溶劑為異丁醇，β-環(huán)糊精濃度為5mmoL/L，添加4%(V/V)的乙醇之后，能夠明顯增加沙丁胺醇熒光強(qiáng)度，最佳pH9；該方法的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率以及檢出限分別為0.13%、96.57%、0.8μg/L。該動(dòng)物尿液中沙丁胺醇?xì)埩舻臒晒夤舛葯z測(cè)方法，整個(gè)過(guò)程只需10～15min，操作方便，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

沙丁胺醇；殘留；動(dòng)物尿液；熒光光度法；快速檢測(cè)

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)屬于β2-興奮劑的一種，化學(xué)名稱(chēng)為1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，是一種能與β2-腎上腺素能受體結(jié)合的藥物，臨床主要用于治療哮喘、支氣管痙攣等[1]。將SAL作為飼料添加劑使用，能顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率[2-3]，長(zhǎng)期超量使用，則會(huì)在動(dòng)物組織中蓄積，人過(guò)量使用這種動(dòng)物產(chǎn)品后會(huì)引發(fā)中毒。

隨著對(duì)“瘦肉精”的監(jiān)察和檢測(cè)力度的增大，一些非法使用者開(kāi)始轉(zhuǎn)向其他替代品。由于沙丁胺醇的結(jié)構(gòu)與“瘦肉精”相似，所以其具有相似的作用[4]；又因?yàn)镾AL在動(dòng)物體內(nèi)消除的時(shí)間較短、毒性較弱，因此SAL就成為“瘦肉精”最主要的替代品[5]。藥物在動(dòng)物體內(nèi)，隨著尿液生成過(guò)程中的濃縮，尿藥濃度逐漸升高，大多遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出血藥濃度，因此易于測(cè)定[6]；其次，尿液也可無(wú)損傷收集，這也是在檢測(cè)藥物濃度時(shí)通常選尿液為檢測(cè)標(biāo)本的原因；此外，檢測(cè)動(dòng)物尿液中的藥物含量，適用于動(dòng)物的宰前控制，可有效地預(yù)防藥物殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品流入市場(chǎng)，對(duì)保障動(dòng)物性食品的安全具有重大意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)SAL檢測(cè)方法的研究還處于起步階段，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于動(dòng)物體內(nèi)SAL殘留檢測(cè)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)行的檢測(cè)方法也很多，有沙丁胺醇的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(high-performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS)[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[10-12]、高效液相色譜法(HPLC)[13-16]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[17-18]等。但這些方法從抗干擾、定量的準(zhǔn)確程度以及檢測(cè)時(shí)間方面都存在一定的問(wèn)題[19]。

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)以豬尿?yàn)榇淼膭?dòng)物尿液前處理手段進(jìn)行研究，建立一種快速、準(zhǔn)確的熒光光度檢測(cè)方法，此方法具有靈敏度高(檢出限為10-4～10-6g/L)，選擇性強(qiáng)、用樣量少、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[20]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

動(dòng)物尿液(豬尿) 鄭州市屠宰廠。

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為亞沸蒸餾水。

AnkeTGL-16c離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；F-850型熒光光度計(jì) 日本日立公司；PHS-2C型精密酸度計(jì)上海大普儀器有限公司；AL204-IC型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

因?yàn)槟蛞褐兴母蓴_成分含量較小，所以在以尿液為檢測(cè)標(biāo)本時(shí)，大都直接進(jìn)行檢測(cè)，不需再做其他處理。本項(xiàng)目中對(duì)尿液樣品檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)尿液樣品一般為黃色，影響檢測(cè)，所以需對(duì)尿液提取后進(jìn)行檢測(cè)。

在Ex/Em波長(zhǎng)為280nm/310nm的條件下檢測(cè)所涉及的各種溶劑、提取液。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由于SAL的Ex/Em波長(zhǎng)為280nm/310nm[21]，為了避免干擾，所選溶劑在280nm/310nm處的熒光強(qiáng)度值要小。依據(jù)資料選擇幾種對(duì)SAL溶解性較好的溶劑進(jìn)行選擇——異丁醇、正丁醇、異丙醇、乙酸乙酯、丙酮、異丁醇＋乙酸乙酯、異丙醇＋乙酸乙酯，對(duì)其做熒光波譜掃描，從抗干擾情況來(lái)看，較為合適的溶劑為乙酸乙酯、異丁醇和正丁醇。

除了抗干擾因素，最佳提取溶劑還將由其提取率確定。根據(jù)以上結(jié)果，取3份10mL 5mg/L SAL溶液，分別加入等體積的乙酸乙酯、正丁醇和異丁醇溶劑萃取，分離出有機(jī)層，干燥后在280nm/310nm測(cè)其熒光強(qiáng)度值(I)，分別與空白溶劑的熒光強(qiáng)度值比較，差值越大則證明其提取率越高，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可看出，異丁醇的提取率較高，說(shuō)明異丁醇對(duì)SAL的熒光強(qiáng)度值影響最小，所以最終確定異丁醇作為提取溶劑。

表1 最佳提取溶劑的選擇Table 1 Screening of optimal solvent for SAL extraction

2.2β-環(huán)糊精(β-CD)與小分子醇的協(xié)同增敏作用

尿液組成比較復(fù)雜，用異丁醇直接提取后效果不理想，可能是由于尿液中有其他物質(zhì)導(dǎo)致SAL熒光猝滅。本實(shí)驗(yàn)采用β-CD來(lái)屏蔽一部分干擾。β-CD具有一個(gè)高為0.79nm、直徑為0.60～0.65nm的筒狀空腔，這種特殊的分子結(jié)構(gòu)賦予β-CD與其極性相似、分子大小與其空腔相匹配的不同類(lèi)型的分子均能形成包絡(luò)物的特性。

尿液經(jīng)異丁醇提取后，分出上層有機(jī)層，加入1mLβ-CD，利用其空腔屏蔽掉一些能夠?qū)е聼晒忖绲囊蛩兀〉昧艘欢ǖ男Ч?shí)驗(yàn)研究了β-CD在濃度為1～10mmol/L范圍內(nèi)的效果。結(jié)果表明，在選定β-CD濃度為5mmol/L時(shí)，β-CD的效果最好(圖1)。

圖1 β-CD濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.1 Effect of β-CD concentration on fluorescence intensity

同時(shí)，對(duì)甲醇、乙醇、正丁醇、異丁醇與β-CD協(xié)同增敏作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在添加了4%(V/V)的乙醇溶液之后，能夠明顯增加SAL熒光強(qiáng)度(圖2)。

圖2 小分子醇對(duì)β-CD的增敏效果Fig.2 Enhancing effect of alcohols on β-CD efficacy for resisting interferences

2.3 pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)pH值在實(shí)驗(yàn)中起著非常重要的影響，影響到異丁醇提取效果。實(shí)驗(yàn)討論了pH值為2～11的異丁醇提取沙丁胺醇的回收率，結(jié)果表明，在pH9的時(shí)候，異丁醇有最佳提取率。

圖3 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度和回收率的影響Fig.3 Effect of pH on recovery rate and fluorescence intensity

2.4 本方法選擇性考察

取7份空白尿液，按照樣品前處理方法處理后，在選定的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光值分別為1.871、1.871、1.870、1.871、1.870、1.871、1.871。此外，表1中異丁醇空白溶劑在Ex/Em波長(zhǎng)為280nm/310nm時(shí)的吸收值為1.831，證明在所選定的實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)處理尿液中的物質(zhì)不影響實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

2.5 本方法的線性范圍考察

分別配制10mL 0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的SAL溶液，加入1mL 5mmol/L的β-環(huán)糊精和4%(V/V)的乙醇后，在Ex/Em為280nm/310nm處測(cè)其熒光強(qiáng)度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～20.0mg/L之間質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度值呈線性關(guān)系。線性方程為y＝1.1971x＋1.8655，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

圖4 SAL質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between SAL concentration and fluorescence intensity

2.6 精密度和回收率

取21份尿樣，分為3組，向每份樣品中分別添加沙丁胺醇儲(chǔ)備液，使添加量為0.05、1.0、10.0mg/L，經(jīng)前處理步驟處理后，調(diào)整pH9，加入5mmol/Lβ-CD 1mL和4%(V/V)的乙醇，測(cè)其熒光強(qiáng)度值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative sandard deviation，RSD)和平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 尿液精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery rates and precision for the determination of SAL in urine

2.7 檢出限

測(cè)定20次尿樣空白，求得標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sb)為0.000308，依據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的建議，計(jì)算檢出限CL＝KSb/m。式中：CL為檢出限；Sb為空白多次測(cè)得信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)；m為分析標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率。測(cè)定20次空白，系數(shù)K＝3、m＝1.19711，因此此方法的檢出限為0.8μg/L。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)得出尿液最佳處理方法是取10mL尿樣，用0.01mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至9，用60mL異丁醇提取，加入1mL 5mmol/Lβ-環(huán)糊精和4%(V/V)的乙醇后，濃縮至10mL，在Ex/Em為280nm/310nm處檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值。

[1] 王國(guó)民, 李應(yīng)國(guó), 張進(jìn)忠, 等. 沙丁胺醇?xì)埩魴z測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2011, 32(5): 453-458.

[2] WARRISS P D, KESTIN S C, ROLPH T P, et al. The effects of thebeta-adrenergic agonist salbutamol on meat quality in pigs[J]. Journal of Animal Science, 1990, 68(1): 128-136.

[3] ZHANG Y T, ZHANG Z J, SUN Y H, et al. Development of analytical method for the determination ofβ-agonist residues in animal tissues by high-performance liquid chromatography with on-line electrogenerated[Cu(HIO6)2]5-luminol chemiluminescence detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(13): 4949-4956.

[4] CARTER W J, LYNCH M E. Comparison of the effects of salbutamol and clenbuterol on skeletal muscle massand carcass composition in senescent rats[J]. Metabolism, 1994, 43(9): 1119-1125.

[5] 王國(guó)民, 李應(yīng)國(guó), 郗存顯, 等. 動(dòng)物組織中沙丁胺醇?xì)埩魴z測(cè)樣品前處理方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(4): 400-404.

[6] 竹磊, 尹紅娜, 陳錦輝. 動(dòng)物肌肉中SAL殘留快速檢測(cè)新方法[J]. 食品科技, 2008, 33(6): 206-208.

[7] 劉茜, 杜紅文, 趙輝, 等. LC-MS-MS法測(cè)定人血漿中硫酸沙丁胺醇濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J]. 中國(guó)藥房, 2009, 20(26): 2031-2033.

[8] JOSEFSSON M, SABANOVIC A. Sample preparation on polymeric solid phase extraction sorbents for liquid chromatographic-tandem mass spectrometric analysis of human whole blood: a study on a number ofbeta-agonists andbeta-antagonists[J]. J Chromatogr A, 2006, 1120(32):1-12.

[9] SPYRIDAKI M H, VONAPARTI P K A, VALA-VANI P, et al. Doping control analysis in human urine by liquid chromatography-electrospray ionization ion trap mass spectrometry for the Olympic Games Athens 2004: determination of corticosteroids and quantification of ephedrines,salbutamol and morphine[J]. Anal Chim Acta, 2006, 573(8): 242-249.

[10] 吳銀良, 劉素英, 劉勇軍, 等. 固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬組織中沙丁胺醇?xì)埩袅縖J]. 分析化學(xué), 2006, 34(9): 23-26.

[11] 劉勇軍, 吳銀良, 劉素英, 等. 固相萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定動(dòng)物組織中的萊克多巴胺、沙丁胺醇[J]. 生命科學(xué)儀器, 2006, 4(2): 15-18.

[12] 王玉飛, 施家威, 范建忠. 高效測(cè)定動(dòng)物性食品中特布他林和沙丁胺醇?xì)埩袅縖J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008, 18(3): 403-404.

[13] 尹菁, 石蓓佳. 高效液相色譜法測(cè)定沙丁胺醇的有關(guān)物質(zhì)[J]. 海峽藥學(xué), 2010, 22(11): 68-70.

[14] 程齊來(lái), 李洪亮, 張道英. HPLC檢測(cè)止咳中藥制劑中的沙丁胺醇[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(2): 80-82.

[15] SHEN Suhui, OUYANG Jin, BAEYENS W R G, et al. Determination ofβ2-agonists by ion chromatography with direct conductivity detection[J]. J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38(17): 166-172.

[16] POLETTINI A, MONTAGNA M, HOGEN-DOORN E A, et al. Applicability of coupled-column liquid chromatography to the analysis ofβagonists in urine by direct sample injection. 1. Development of a singleresidue reversed-phase liquid chromatography-UV method for clenbuterol andselection of chromatographic conditions suitable for multi-residue analysis[J]. J Chromatogr A, 1995, 695(22): 19-31.

[17] 孫海新, 凌紅麗, 王雷, 等. 沙丁胺醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2009, 26(12): 44-47.

[18] 王保玲, 袁利鵬, 雷紅濤, 等. 沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法快速測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(20): 270-274.

[19] 尹紅娜, 伍季, 劉紅偉. 動(dòng)物血液中SAL殘留快速檢測(cè)新方法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(36): 11851-11852.

[20] 許金鉤, 王尊本. 熒光分析法[M]. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 15.

[21] 黃新萍, 黃曉霞, 謝守霞, 等. 熒光分光光度法測(cè)定硫酸沙丁胺醇片的含量[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2005, 32(5): 562-563.

Rapid Detection of Salbutamol Residue in Animal Urine

WU Ji1,2，YIN Hong-na2,*，ZHU Lei1，LWei1
(1. Henan Food Quality and Safety Control Engineering Research Center, Zhengzhou 450002, China；2. Henan Commerce Science Institute Co. Ltd., Zhengzhou 450002, China)

In order to explore a rapid method for the determination of salbutamol (SAL) residues in animal urine, the impacts of extraction solvent,β-CD concentration for synergistic sensitization with small alcohol molecules and pH on determination results were explored. The optimal extraction solvent was isobutanol, aβ-CD concentration of 5 mmol/L was found optimal,and under these conditions, the fluorescence intensity of SAL was enhanced remarkably by adding 4% ethanol. The optimal pH was 9. The precision (RSD), recovery rate and detection limit of this method were 0.013%, 96.57% and 0.8 μg/L, respectively.The whole course of SAL determination by this method could be completed within 10－15 min. This method was simple, efficient,and suitable for thein situdetermination of SAL residue.

salbutamol (SAL)；residue；animal urine；fluorescence method；rapid detection

O657.3；TS207.3

A

1002-6630(2012)16-0208-04

2011-07-15

河南省預(yù)研項(xiàng)目(0641190102)

伍季(1956—)，男，高級(jí)工程師，本科，主要從事食品安全研究。E-mail：zzwuji@sina.com

*通信作者：尹紅娜(1979—)，女，工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。E-mail：nana0705@163.com