肉桂原花青素的提取及其對高級糖基化終產物形成的抑制作用

黎 超，毛超倫，雍克嵐*

(上海大學生命科學學院，上海 200444)

肉桂原花青素的提取及其對高級糖基化終產物形成的抑制作用

黎 超，毛超倫，雍克嵐*

(上海大學生命科學學院，上海 200444)

通過單因素和正交試驗確定肉桂中原花青素(proanthocyanidins of cinnamon，CPAs)最佳水提工藝條件，比較9種大孔吸附樹脂對CPAs的吸附與解吸性能，對CPAs進行體外蛋白非酶糖化抑制實驗。結果表明：最佳提取條件為液料比14:1(mL/g)、提取溫度60℃、pH5.0、提取時間2h，CPAs提取得率為14.27mg/g，LSA-21大孔吸附樹脂分離純化CPAs效果最佳。該肉桂提取物對高級糖基化終產物的形成具有很好的抑制活性，其IC50為45.93 μg/mL，高于陽性對照氨基胍。

肉桂；原花青素；大孔樹脂；高級糖基化終產物

肉桂為樟科樟屬常綠喬木肉桂的干燥樹皮，是一種藥食兩用植物資源。肉桂原花青素含量豐富，居98種常見食物原料之首[1]，高于葡萄籽。原花青素是由兒茶素或表兒茶素通過C4－C6或C4－C8聚合而成的一大類酚類聚合物，是一類植物體次級代謝產物，因其顯著的抗氧化、清除自由基性質而對心血管疾病的預防以及增強免疫、抗炎、抗癌等具有較好作用[2]。我國肉桂產量占世界的80%以上[3]，因此從肉桂中提取原花青素具有很好的前景。

高級糖基化終產物(advanced glycation endproducts，AGEs)是指還原糖與蛋白質、脂質或核酸的氨基基團發生非酶促反應形成的一類復雜的不可逆聚合物[4]。現代研究證實AGEs在糖尿病并發癥的發病機制中起著重要作用，AGEs在體內的蓄積能誘發糖尿病腎病、白內障、神經病變[5-6]以及動脈硬化[7]和Alzheimer,s病[8-9]等。這些嚴重的糖尿病并發癥是導致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。因此篩選開發AGEs形成的抑制劑，對于預防和治療糖尿病并發癥，有重要意義。

迄今為止，關于肉桂抗AGEs形成的研究鮮有報道。本實驗對肉桂原花青素提取工藝優化及其抗AGES形成抑制活性進行研究，為肉桂的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂 廣東省高要市；(+)-兒茶素(含量≥99%) 中國藥品生物制品檢定所；氨基胍鹽酸鹽 美國Sigma公司；NaN3美國Ameresco公司；牛血清白蛋白(BSA)北京鼎國生物技術有限公司；AB-8、ADS-17、ADS-21大孔樹脂 天津南開和成科技有限公司；D-101、LSA-10、LSA-21、LSA-40、XDA-1大孔樹脂 西安藍曉科技有限公司；HP-20樹脂 日本三菱化學公司。其他化學試劑均為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑。

1.2 儀器與設備

LS-55型熒光分光光度計 美國PerkinElmer公司；Cary 100型紫外-可見分光光度儀 美國Varian公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀 美國尼高利儀器公司；SPX-150B型生化培養箱 上海瑯玕實驗設備有限公司；EYELA N1001型旋轉蒸發儀日本東京理化株式會社；ALPHA2-4型凍干機 德國Christ公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉桂原花青素的提取工藝

肉桂→粉碎→熱水浸提→抽濾→濾液濃縮→醇沉→離心分離→上清液→濃縮除醇→凍干即得CPAs

操作要點：以3g肉桂為原料，經粉碎后，以水為溶劑，用醋酸鹽緩沖液調pH值，加熱提取，經過濾、濾液濃縮、3倍體積乙醇過夜沉淀、離心分離、減壓濃縮、凍干等步驟得到粗原花青素。

1.3.2 原花青素含量檢測

采用香草醛-濃鹽酸[10]法，以兒茶素為標準品制作標準曲線，得回歸方程：y＝0.0035x－0.0359，R2＝0.9995，其中y為吸光度，x為(+)-兒茶素質量濃度/(μg/mL)，線性質量濃度范圍為50～250μg/mL。取肉桂提取凍干樣，溶解稀釋到一定體積V/mL，按標準曲線法測定其吸光度，根據回歸方程計算原花青素含量C/(μg/mL)。按下式計算原花青素得率：

式中：M提取物為肉桂提取凍干樣質量/mg；M原料為肉桂原料質量/g。

1.3.3 單因素與正交試驗

選擇提取溫度、液料比、提取時間、pH值等單因素進行試驗，在單因素經驗基礎上，選擇液料比、提取溫度和提取時間為考察因素，每個因素擬定3個水平，選用L9(33)正交試驗表，以原花青素得率作為考核指標，進行正交試驗篩選最佳水提工藝條件，因素水平見表1。

表1 肉桂原花青素的提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.4 大孔樹脂靜態吸附與解吸

稱取經預處理的干樹脂2g于100mL具塞三角瓶中，加入肉桂水提稀釋液70mL，室溫振蕩(100r/min)5h，至吸附平衡，過濾，取上清液測定原花青素含量，計算吸附率。靜態吸附完畢，抽濾后用純凈水洗淋。把樹脂轉移至三角瓶中，加入20mL 70%乙醇溶液，室溫100r/min振蕩5h，取上清液，測定原花青素含量，計算解吸率。

1.3.5 體外蛋白非酶糖化抑制測定[11]

在pH7.4 PBS緩沖液中加入葡萄糖、BSA、NaN3，使其終質量濃度分別為500mmol/L、50mg/mL和0.2g/L，完全溶解后分裝入具塞試管中(每管5mL)；加入待測樣品(0.1mg/mL)，氨基胍為陽性對照組，同時設不加試樣的空白對照。

各組反應液置37℃避光密封孵育，7d及30d后，用熒光分光光度儀對空白對照組進行激發波長與發射波長的預掃描，所得最大吸收值時對應波長即為最佳測試條件。在該條件下檢測各組的熒光強度值F。計算肉桂原花青素對AGEs形成的抑制率：

2 結果與分析

2.1 肉桂原花青素提取工藝單因素試驗

2.1.1 浸提溫度對原花青素得率的影響

在為液料比10:1、浸提時間1.5h、pH6.0條件下，不同提取溫度對肉桂原花青素得率的影響見圖1。由圖1可知，隨著浸提溫度的升高，肉桂原花青素得率呈上升趨勢，當浸提溫度達到60℃后上升變化較為緩慢，從節約能源和提高得率的角度考慮，確定浸提溫度以60℃為宜。

圖1 浸提溫度對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of CPAs

2.1.2 液料比對原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、浸提時間1.5h、pH6.0的條件下，不同液料比對肉桂原花青素得率的影響見圖2。由圖2可知，肉桂原花青素得率隨著溶劑量的增加而增加，當液料比達到14:1后上升變化較為緩慢，所以確定浸提的液料比以14:1為宜。

圖2 液料比對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of liquid/solid ratio on extraction rate of CPAs

2.1.3 浸提時間對原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、液料比14:1、pH6.0條件下，不同浸提時間對肉桂原花青素得率的影響見圖3。由圖3可知，浸提2.5h左右效果最好，時間過長，對肉桂原花青素提取效果反而不好，所以浸提時間選擇2.5h為宜。

圖3 浸提時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of CPAs

2.1.4 浸提液pH值對原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時間2h條件下，不同提pH值浸提對肉桂原花青素得率的影響見圖4。由圖4可知，隨著pH值的升高，肉桂原花青素得率呈下降趨勢，當pH值達到6后下降明顯，確定浸提pH值以5為宜。

圖4 浸提液pH值對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate of CPAs

2.2 正交試驗

分析結果表明，3種考察因素對CPAs提取率影響的大小順序為B＞C＞A，即液料比＞浸提時間＞浸提溫度。液料比太小，提取不完全；提取時間太長，得率下降；原花青素在高溫下具有熱不穩定性，易聚合形成高聚體的鞣質。所以其適宜提取工藝條件：浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時間2h、pH5.0，此工藝條件下原花青素得率為14.27mg/g。

表2 肉桂原花青素提取工藝正交試驗結果和極差分析表Table 2 Results of orthogonal tests and range analysis

2.3 大孔樹脂純化試驗

通過9種大孔吸附樹脂的靜態吸附與解吸試驗，發現HP-20、D-101、LSA-21樹脂對肉桂原花青素的吸附性能較好；ADS-21、LSA-21、LSA-40樹脂的解吸性能較好。結合樹脂價格綜合考慮，確定選用LSA-21樹脂對肉桂水提原花青素進行純化。肉桂水提物經LSA-21樹脂純化后原花青素含量達75%。

表3 大孔樹脂的靜態吸附解吸實驗結果Table 3 Static adsorption and desorption performance of macro-porous resins

2.4 肉桂原花青素對AGEs形成的影響

2.4.1 AGEs熒光光譜掃描

設定發射波長450 nm，激發波長范圍為20 0～440nm，激發狹縫4nm，發射狹縫4nm，掃描步長5nm，掃描速度500nm/min，掃描圖見圖5。

圖5 AGEs的熒光光譜等高線圖Fig.5 Fluorescence contour spectra of AGEs

由圖5可知，在λEx＝380nm，λEm＝450nm處有最高熒光峰，因此本實驗選擇λEx＝380nm，λEm＝450nm，激發狹縫＝4nm，發射狹縫＝4nm，發射光濾光片＝390nm(Cut-off)作為AGEs測定參數。

2.4.2 肉桂原花青素對AGEs形成的抑制作用

氨基胍是一種親核肼類小分子化合物，是目前比較公認的AGEs形成抑制劑。作用機制主要是氨基胍能捕獲非酶糖化中間產物如甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)和3-脫氧葡糖糖醛酮(3-DG)等反應性羰基化合物，形成無生物毒性的加合物，從而抑制AGEs形成。但由于其在美國和加拿大等國進行Ⅲ期臨床試驗中表現出顯著副作用[4]，而最終沒得以商業化生產與應用。由不同濃度CPAs在孵育第30天時對AGEs形成的抑制率計算得其IC50為45.93μg/mL，高于陽性對照氨基胍的92.30μg/mL。同時對比圖6可知，CPAs在非酶糖化反應孵育7d(AGEs形成的早期)就顯示出顯著抑制作用，而同時期氨基胍抑制效果較差，表明CPAs的抑制機制有別于氨基胍。關于原花青素抑制糖基化反應的作用機理，經初步分析認為原花青素為多酚物質，具有較強抗氧化活性，能清除還原性羰基化合物，同時原花青素屬縮合單寧，它能在非酶糖化反應前與相關蛋白結合從而阻止AGEs的形成。

圖6 肉桂原花青素(A)和氨基胍(B)對AGEs形成的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of CPAs and aminoguanidimine (positive control) on AGEs formation

2.5 肉桂原花青素的定性鑒定

原花青素本身無色，在熱酸條件下降解、氧化可產生深紅色花色素離子，反應后溶液為深紅色，則表明發生了花色素反應，其產物在546nm處有強吸收。本實驗取大孔樹脂純化后的凍干粉末經正丁醇-鹽酸分析呈現陽性反應，表明粉末中有原花青素存在。肉桂提取物凍干粉經紫外可見及紅外光譜掃描，結果見圖7、8。

圖7 CPAs 的紫外-可見光譜圖Fig.7 UV-visible spectrum of CPAs

圖8 CPAs 的紅外光譜圖Fig.8 IR spectrum of CPAs

紫外可見掃描表明CPAs在280nm處有唯一吸收峰，紅外掃描圖譜表明含多羥基及苯環，與原花青素結構特征相符。

3 結 論

肉桂在浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時間2h、pH5.0條件下水提，原花青素得率為14.27mg/g。LSA-21樹脂對肉桂原花青素具有較好的吸附與解吸性能，經其純化后原花青素含量可達75%。

肉桂原花青素對體外蛋白非酶糖化具有顯著抑制作用，其IC50為45.93μg/mL，高于陽性對照氨基胍，且有別于氨基胍能對非酶糖化早期反應進行抑制。提示肉桂對于糖尿病并發癥也具有潛在的防治作用。

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Water Extraction of Cinnamon Proanthocyanidins and Its Inhibitory Effect on the Formation of Advanced Glycation End Products

LI Chao，MAO Chao-lun，YONG Ke-lan*
(School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

One factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to determine the optimal operating conditions for water extraction of proanthocyanidins from cinnamon (CPAs). Nine types of macroporous adsorption resin were compared for their effectiveness in adsorbing and desorbing CPAs. Meanwhile, the in vitro inhibitory effect of CPAs on the formation of advanced glycation end products (AGEs) was tested. The optimal extraction conditions were found to be 2 h of extraction at 60 ℃with acidic water at pH 5.0 (adjusted with sodium acetate-acetic acid buffe) at a liquid/solid ratio of 14:1 (mL/g). Under these conditions, the extraction rate of CPAs was 14.27 mg/g. LSA-21 resin was the most effective in purifying CPAs. CPAs had strong inhibitory activity on the formation of AGEs with an IC50 of 45.93μg/mL, which was higher than that of the positive control aminoguanidimine.

cinnamon；proanthocyanidins；macroporous resin；advanced glycation end products

TS201.1

A

1002-6630(2012)08-0126-05

2011-03-25

黎超(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：jackylc@shu.edu.cn

*通信作者：雍克嵐(1947—)，女，教授，研究方向為天然產物開發利用。E-mail：klyong@staff.shu.edu.cn