雙核鎳配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O與DNA作用和細胞凋亡研究

武光磊， 湛 琳， 徐 進， 高恩軍

(沈陽化工大學配位化學研究室沈陽市無機分子基材料化學(國際)重點實驗室，遼寧沈陽 110142)

DNA是生物體中重要的一類生物大分子，對于生命遺傳密碼的翻譯、轉錄、復制起著非常重要的作用.順鉑(cis-DDP)，奧沙利鉑、卡鉑等鉑配合物作為廣譜抗腫瘤藥物在臨床上的廣泛應用，促使很多研究者研究了大量金屬配合物與DNA的反應，探討金屬配合物與DNA作用的反應機理，進而研究金屬配合物的分子結構及與DNA反應機理的關系，為篩選出新的生物學研究工具，設計合成出具有應用前景的低毒、高效、抗菌、抗腫瘤藥物提供一定的科學研究基礎及理論根據［1-5］.

1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸存在眾多配位原子，可分步失去質子，表現出靈活多變的配位方式.配體本身具有較好的水溶性，其氮氧原子易分別與親氮和親氧離子配位，其2-位氮原子還可提供氫鍵作用或配位作用.此外，基于Htda有機分子配體配合物性質的報道目前還很少，本文參照文獻［6］合成雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O.Barton 等人［7］提出［Ru(phen)3］2+與DNA作用時有插入和靜電作用2 種模式，Norden 等人［7］則認為［Ru(phen)3］2+與DNA 作用時只存在靜電作用1種模式［1，6］.金屬配合物與DNA之間的作用機理與模式一直存在一定的爭議，針對此問題用紫外分光光度法、熒光分光光度法和凝膠電泳法對雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O與DNA之間的相互作用進行研究，研究結果顯示此配合物主要以靜電作用與DNA結合，但也存在一定的插入作用.此外，對配合物引發細胞凋亡的能力與順鉑做比較，結果顯示細胞凋亡效果明顯區別于順鉑.

1 實驗部分

1.1 儀器

PXJ21C數字顯示離子計，配丹麥2401B型Ag/AgCl復合電極;Nicolet IR2470型紅外光譜儀，KBr壓片;Bruker CCD晶體衍射儀;UV-240島津近紅外可見紫外分光光度計，日本島津;PerkinElmer熒光分光光度計，美國鉑金埃爾默;培清凝膠成像分析系統，上海培清.

1.2 試劑

小牛胸腺DNA，國藥集團產品;Hela細胞DNA，本實驗室自己提取，相對分子質量大于30 000，用前作進一步稀釋處理，純度以260 nm處吸光度與280 nm處吸光度的比值檢測(A260/A280=1.9);其他試劑均為分析純.

1.3 配合物的合成

按文獻［7］方法合成雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O，元素分析、單晶衍射和紅外吸收光譜與文獻［7］報道一致.

1.4 實驗過程

研究配合物與DNA的作用時，樣品均溶解在含5 mmol·L-1Tris(三羥甲基氨基甲烷)和50 mmol·L-1NaCl的二次蒸餾水緩沖液(pH=7.10)中，小牛胸腺DNA和Hela細胞DNA的濃度以ε260=6 600 L·mol-1·cm-1確定.

2 結果與討論

2.1 配合物的結構

從圖1可看出，2個金屬Ni(Ⅱ)原子分別與4個氧原子(3個來自水分子，1個來自Htda配體)和2個氮原子(分別來自2個Htda配體)配位螯合成2個五元環和1個六元環的近平面穩定結構.在配合物的單元分子中，存在4個游離水分子，為維系空間結構穩定性氫鍵的形成提供基石.在Ni(1)和Ni(2)兩個鎳原子形成的配位鍵中，Ni(1)—N(3)和Ni(1)—N(5)的鍵長分別 為 0.206 67 nm 和 0.205 03 nm，Ni(2)—N(2)和 Ni(2)—N(4)的鍵長分別為0.202 95 nm和0.206 19 nm，N(5)—Ni(1)—N(3)和N(2)—Ni(2)—N(4)的鍵角分別為96.000°和96.477°，二者都存在略微的差異，同樣Ni(1)和Ni(2)與氧原子之間的配位也存在略微的差別，但整個配合物近乎是一個對稱結構.水分子的體積忽略，則可看做一個大五元環六元環交錯的平面矩形.配合物的部分晶體數據如下:空間群:C2/c;F(000):2 504;衍射映像/獨特性:11 954/3 762［R(int)=0.029 2］;完整性，%:99.6;擬合度 F2:1.058;數據/限制/參數:3 762/4/360;R最終指數(I＞2σ(I)):R1=0.317，wR2=0.074 9;R指數(所有數據):R1=0.039 9，wR2=0.080 4.

圖1 配合物單元結構(氫原子被省略)Fig.1 Complexes with structural(H atoms are omitted)

2.2 紫外光譜法研究雙核鎳(Ⅱ)配合物與小牛胸腺DNA作用

紫外光譜法是很多種檢測配合物與DNA作用的方法之一［8］.含有堿基生色團的雙螺旋結構DNA分子，其UV/Vis吸收光譜在260 nm附近有一強吸收峰，當小分子與核酸結合后，對核酸或小分子吸收峰的吸收光譜都會引起變化，可根據相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對金屬配合物與作用模式進行判斷.對于DNA的吸收光譜:如導致構象變化，則產生減色效應和紅移現象，且作用越強減色效應越明顯;如導致DNA雙螺旋結構的破壞，則產生增色效應［9］.對于金屬配合物等小分子的特征吸收譜帶，當金屬配合物嵌插到DNA堿基對中，即發生插入作用時，將會發生減色效應，這是因為DNA堿基對與插入配體間發生π電子堆積，使后者的π*空軌道上也有一定的電子填充，從而使電子從金屬轉移到配體上躍遷(MLCT躍遷)的幾率減少.減色效應的強弱，能夠反映插入能力的大小，插入能力越強，減色效應越強.與DNA發生插入作用后的配合物，插入配體與DNA堿基對間發生π電子堆積后，配合物的配體共軛性加強，產生紅移現象，紅移程度反映出插入能力的大小.插入能力強的配合物，紅移較大，插入能力弱的配合物，紅移較小［10］.

配合物與小牛胸腺DNA作用的紫外光譜圖見圖2.配合物在波長為210～360 nm的紫外范圍內有明顯的特征吸收峰，為芳香氮堿配體內的n-π*電子躍遷形成，DNA的摻入使配合物各特征吸收峰在波長發生明顯的減色效應，DNA濃度越大，趨勢越明顯，并有等色點生成.說明配合物與DNA之間建立了新的平衡關系，生成新的化合物物種.配合物以靜電方式與DNA螺旋堿基對結合，發生孤對電子靜電吸引作用，配體上孤對電子數目減少，使n-π*躍遷幾率減小，產生減色效應.

圖2 配合物與DNA作用的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of complex with DNA

2.3 熒光光譜法研究雙核鎳(Ⅱ)配合物與小牛胸腺DNA的作用

溴化乙錠(EB)具有共軛芳香環的平面結構，能專一平行地嵌入DNA雙鏈的配對堿基之間.在水溶液中，其本身熒光極弱，而DNA分子幾乎沒有熒光.但當溴化乙錠插入雙鏈DNA分子之后，溴化乙錠分子借助其與堿基之間的堆積作用而能平行地“固定”在DNA分子內部，從而使溴化乙錠分子平面剛性增加，碰撞淬滅減小，發出的熒光強度大概提高了10倍［11］.溴化乙錠不能插入單鏈DNA中，而只能插入雙螺旋DNA分子中，因為它與DNA的插入作用是通過堿基間堆積而產生的.因而溴化乙錠是一種能與DNA雙鏈發生專一插入作用，且選擇性好，靈敏度高的熒光探針.

如果配合物是以插入方式與DNA結合，那么就能與DNA發生類似EB的插入作用，從而競爭EB與DNA結合的位點，釋放出EB，使EB/DNA復合體系熒光減弱:M+EB·DNA=M·DNA+EB.根據經典斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程［12］:I0/I=1+Ksq·r. 其中:I和 I0分別代表復合物(配合物/EB/DNA)中存在和不存在配合物時的熒光強度;r為復合物中配合物與小牛胸腺DNA的濃度比;Ksq表示斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)淬滅常數，其可以定量描述配合物與DNA的作用強弱.從Ksq值的大小就可以定量地比較幾個化合物在相同條件下與DNA作用的強弱程度，Ksq值越大，作用強度越大，結合能力越強.

配合物與DNA作用的熒光光譜圖見圖3.

圖3 配合物對DNA-EB體系熒光強度的影響Fig.3 Emission spectrum of EB bound to DNA in the presence of the complex

從圖3可以看出，隨著配合物濃度的增加，DNA-EB復合物的體系熒光強度逐漸減弱，且發生了一定程度的淬滅，并且濃度越大，熒光猝滅逐漸趨于平衡.當配合物的濃度逐漸增加到最大時，配合物把DNA-EB復合物體系的熒光強度約由135淬滅到115，下降幅度為20.由斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程作圖，見圖4.配合物的斯特恩-沃爾默淬滅常數值(Ksq)為0.053 0.這一現象說明配合物與DNA發生了一定程度的插入作用，但作用微弱，說明配合物分子與DNA結合主要以靜電模式，同時存在一定的插入作用.

圖4 配合物對DNA-EB體系作用的stern圖Fig.4 Interaction with the DNA-EB system

2.4 凝膠電泳技術研究雙核鎳(Ⅱ)配合物對Hela細胞DNA的切割作用

在外電場作用下，帶電荷物質會向著與其所帶電荷電性相反的電極移動.DNA中存有親水性的磷酸基團，在高于其等電點的緩沖溶液中帶負電荷，從而使DNA在電場中通過凝膠介質向正極泳動.影響DNA在凝膠介質中移動的因素主要有電荷效應、凝膠介質的分子篩效應.在電荷相同的條件下，凝膠介質的分子篩效應至關重要，其與相對分子質量大小及構型有關;相對分子質量越小，空間構型產生的空間位阻越小，遷移位置就越靠前，而DNA帶間的距離也就越大.當共價閉環型DNA的一條鏈上出現一個缺口時，超螺旋結構解開，形成開環型結構;若2條鏈在同一位置發生斷裂時，則成為線形分子.某些能插入DNA雙螺旋堿基對之間的試劑如EB、放線菌素D可以改變DNA的超螺旋狀態，使負超螺旋減少，以至完全松開形成單鏈開環結構，甚至形成正超螺旋，進而能通過凝膠電泳實驗表現出來［13-14］.基于上述原理及前面的熒光法實驗結果，以凝膠電泳實驗來研究配合物對DNA的切割作用.

配合物的凝膠電泳實驗結果見圖5.在圖5中，Lane 0是純的 DNA，Lane 1～4分別為10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L 的配合物與DNA在有氧條件下反應2 h的電泳圖像.隨著配合物濃度的增大，配合物使質粒DNA的超螺旋帶(FormⅠ)和開環帶(FormⅡ)沒有明顯增多，而且無線性帶(FormⅢ)出現.此結果可以看出，配合物對DNA的切割能力比較微弱，這個結果與上述的熒光淬滅實驗中的趨勢相一致，原因很有可能是 1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸是一個富電子的小平面結構配體，配合物與DNA結合模式主要以靜電作用為主，插入作用相對較弱.

圖5 配合物對Hela DNA切割作用的電泳圖Fig.5 Cleavage of Hela DNA in the presence of complex

2.5 雙核鎳(Ⅱ)配合物對Hela細胞的形態學影響研究

細胞凋亡［15-17］，又稱細胞程序性死亡，是指細胞在一定的生理和病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程.細胞凋亡不同于細胞壞死，是程序性死亡過程的一種主要形式，強調的是形態學上的改變.將處理好的爬片放在光學顯微鏡下進行觀察、拍照.從圖6(a)可以看出，正常Hela細胞在染色后呈不規則的多角形，細胞與細胞間連接緊密，細胞核完整，染色體均勻淡藍色，屬正常生長狀態.圖6(b)是順鉑作用下Hela細胞凋亡的形態，細胞間隙增大，細胞變圓，變小，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有出芽現象，并伴有凋亡小體.配合物作用過的細胞也發生了類似的變化(見圖6(c))，可明顯地觀察到凋亡的形態學特征.由此看出，Hela細胞在配合物的作用下發生了一定程度上的凋亡，但引起細胞凋亡的作用效果明顯沒有順鉑強烈.

圖6 Hela細胞培養48 h后經染色在顯微鏡下的形態Fig.6 The shape of the staining of HeLa cells under the microscope after 48 h

3 結論

經過對配合物與DNA作用的研究，表明雙核鎳(Ⅱ)配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O對DNA具有一定的結合能力，結合的作用模式主要以靜電作用為主，同時存在插入作用，是二者共同作用的結果.通過配合物對細胞形態學影響的研究，發現此配合物可以引起細胞一定程度上的程序性死亡，但細胞凋亡效果明顯沒有順鉑強烈.

［1］ Gao En-jun，Wang Lei，Zhu Ming-chang，et al.Synthesis，Characterization，Interaction with DNA and Cytotoxicity in Vitro of the Complexes［M(dmphen)(CO3)］H2O［M=Pt(Ⅱ)，Pd(Ⅱ)］［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45(1):311-316.

［2］ Barton Jacqueline K，Goldberg Jonathan M，Kumar Challa V，et al.Binding Modes and Base Specificity of Tris(phenanthroline)ruthenium(Ⅱ)Enantiomers with Nucleic Acids:Tuning the Stereoselectivity［J］.J.Am.Chem.Soc.，1986，108(8):2081-2088.

［3］ Gao En-jun，Zhu Ming-chang，Liu Lei，et al.New PH-dependent Complexes，from Mononuclear Pd(Ⅱ)Monomer to Heteronuclear［Pd(Ⅱ)，K(Ⅰ)］Polymer:DNA Cleavage and Cytotoxicity in Vitro［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:3261-3270.

［4］ Gao En-jun，Wang Ke-hua，Zhu Ming-chang，et al.Hairpin-shaped Tetranuclear Pallad Ium(Ⅱ)Complex:Synthesis，Crystal Structure，DNA Binding and Cytotoxicity Activity Studies［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:2784-2790.

［5］ Bakalova Adriana，Varbanov Hristo，Buyukliev Rossen，et al.Synthesis，Characterization and Biological Activity of Pt(Ⅱ)and Pt(Ⅳ)Complexes with 5-methyl-5(4-pyridyl)-2，4-imidazolidenedione［J］.Eur.J.Med.Chem，2008，43(5):958-965.

［6］ Pyle A M，Rehmann J P，Meshoyrer R，et al.Mixedligand Complexes of Ruthenium(Ⅱ):Factors Governing Binding to DNA［J］.J.Am.Chem.Soc.，1989，111(8):3051-3058.

［7］ Zhou Xin-hui，A Dinuclear Ni(Ⅱ)Complex［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O:Synthesis，Crystal Structure and Properties［J］.China.J.Inorg.Chem.，2010，26(5):801-806.

［8］ Gao En-jun，Sun Tie-dong.Synthesis，Characterization，Interaction with DNA and Cytotoxicity in Vitro of Novel Pyridine Complexes with Zn(Ⅱ)［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45(10):4534-4536.

［9］ 吳紅星，李風華，林華寬，等.二胺橋聯鄰菲啰啉衍生物的合成及其與DNA相互作用研究［J］.無機化學學報，2005，21(1):117-122.

［10］李紅，樂學義，吳建中，等.銅(Ⅱ)鄰菲咯啉蛋氨酸配合物與 DNA相互作用研究［J］.化學學報，2003，16:245-250.

［11］ Holder A A，Swavey S.Design Aspects for the Development of Mixed-metal Supramolecular Complexes Capable of Visible Light Induced Photocleavage of DNA［J］.Inorg.Chem.，2004，43(1):303-308.

［12］張黔玲，劉劍洪，任祥忠，等.新型雙核配合物的形成與DNA的作用機制及熒光性質研究［J］.化學學報，2006，64(10):968-974.

［13］王得寶，祁國榮.核酸:上冊［M］.北京:科學出版社，1987:55.

［14］袁彩霞.DNA斷裂劑的合成與識別基寡聚脫氧核苷酸的偶聯及其作用機理［D］.太原:山西大學，2004.

［15］ Wu Kuang-shi，Liu Ji-hua，Johnson Russell N，et al.Drug-free Macromolecular Therapeutics:Induction of Apoptosis by Coiled-coil-mediated Cross-linking of Antigens on the Cell Surface［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49:1451-1455.

［16］ Jung Jongjin，Solanki Aniruddh，Memoli Kevin A，et al.Selective Inhibition of Human Brain Tumor Cells Through Multifunctional Quantum-dot-based SiRNA Delivery［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49:103-107.

［17］彭黎明，王曾禮.細胞凋亡的基礎與臨床［M］.北京:人民衛生出版社，2000:184-186.