類風濕性關節炎患者早期外周血單個核細胞Toll樣受體2、4表達及意義

錢 雷， 汪曉鶯， 呂麗君， 陳德訓

(1．濱海縣人民醫院檢驗科，江蘇濱海 224500;2．南通大學免疫學教研室，江蘇南通 226001)

類風濕性關節炎患者早期外周血
單個核細胞Toll樣受體2、4表達及意義

錢 雷1， 汪曉鶯2， 呂麗君2， 陳德訓1

(1．濱海縣人民醫院檢驗科，江蘇濱海 224500;2．南通大學免疫學教研室，江蘇南通 226001)

目的 探討類風濕性關節炎(RA)早期患者外周血單個核細胞(PBMC)Toll樣受體(TLR)2、TLR4對其配體雙糖鏈蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反應性，闡明PBMC TLR2、TLR4在RA疾病早期中的作用。方法 采用流式細胞術、實時熒光定量逆轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測BGN和LPS刺激前后，RA組和健康對照組外周血CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率、PBMC TLR2mRNA和TLR4 mRNA及上清液白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的含量變化。結果 RA早期患者TLR2 mRNA明顯升高、TLR4 mRNA下降(P＜0．01);經LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA升高3．50倍，而健康對照組下降到0．11倍;LPS和BGN促進了各組PBMC產生IL-6、TNFα，但RA早期患者組上升的倍數明顯高于健康對照組。結論 PBMC TLR2、TLR4參與早期RA的發生、發展。

Toll樣受體2;Toll樣受體4;外周血單個核細胞;類風濕性關節炎

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是生物的一種模式識別受體，其主要通過識別并結合病原體相關分子模式來啟動免疫反應。到目前為止，在人體內至少有11種TLR相繼被鑒定。有研究發現，TLR2、TLR4與類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)有重要的關系。在RA患者滑膜成纖維細胞中，可檢測到TLR2、TLR4、TLR3和TLR7［1］;RA關節腔滑液中巨噬細胞與正常巨噬細胞相比，高表達TLR2和TLR4［2］。但外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)TLR2、TLR4對早期RA的影響少見報道，本研究通過檢測 RA早期患者 PBMC TLR2、TLR4，并觀察對其各自特異性配體雙糖鏈蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反應性，闡明PBMC TLR2、TLR4在早期RA疾病中的作用。

材料和方法

一、研究對象

選取2010年9月至2011年3月在南通大學附屬醫院門診部就診的RA早期診斷患者20例，符合2009年美國風濕病學會和歐洲抗風濕聯盟聯合推出的RA診斷標準，均處于亞急性活動期，RA活動度評分(DAS-28)均在2．6～5．1之間。用藥前采集標本。健康對照者20名，無相關自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史。各組間性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0．05)，見表1。

表1 RA早期患者和健康對照者臨床資料

二、主要試劑和儀器

抗人 TLR4抗體、抗 TLR2抗體、藻紅蛋白(PE)-鼠抗人TLR4抗體購自eBioscience公司，異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人CD14、逆轉錄(RT)試劑盒為Invitrogen產品，RPMI 1640培養基溶液購自Gibco公司，聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生物工程公司合成，SYBR GreenⅠ購自上海閃晶分子生物科技公司，LPS、BGN購自 Sigma公司，白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Bender MedSystems公司，熒光定量PCR儀為Corbett RG-3000。

三、方法

1．LPS、BGN刺激單個核細胞 Ficoll-Histopaque液分離10 mL肝素抗凝靜脈血PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，860×g離心7 min，去上清，用RPMI 1640完全培養基(10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)重懸，分組種于24孔培養板，細胞濃度為1×106個/mL，加入不同濃度LPS、BGN(抗人TLR抗體孔在加入刺激劑前將體積為100μL細胞與5μL抗體先共育30 min)，置于 37℃ 5%CO2溫箱培養 48 h，ELISA檢測上清液細胞因子IL-6、TNFα濃度;收集細胞，PBS洗滌后，檢測 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，流式細胞術檢測CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率。

2．實時熒光定量RT-PCR檢測單個核細胞TLRmRNA Trizol提取細胞總RNA，按RT試劑盒操作說明合成cDNA，然后進行實時熒光定量PCR檢測。TLR2引物序列，上游:5'-GGAAGAATCCTCCAATCAGGC-3'，下游 5'-CTTCTGTGAGCCCTGAGGGA-3';TLR4引物序列，上游:5'-GAACCTGGACCTGAGCTTTAATC-3'、下 游 5'-AGATTGGATAAGATTGTGAGCCAC-3'，內對照 GAPDH引物序列:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下 游 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。實時熒光定量RT-PCR采用25μL反應體系:2μL cDNA、12．5 μL 2 × SYBR Green Supermix、200 nmol/L上下游引物各1 μL、ddH2O 8．5 μL，按95 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45個循環，循環結束后做熔解度分析。

3．流式細胞儀檢測CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率 取2×105PBMC，加入100μL PBS，與5 μL PE-鼠抗人 TLR4、5 μL FITC-鼠抗人 CD14室溫避光溫育30 min，PBS洗滌后，用200μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測TLR4+CD14+細胞占CD14+細胞百分比。

四、統計學方法

應用Stata統計分析軟件進行方差齊性、正態性檢驗、兩組比較t檢驗，檢驗水準α設為0．05。

結 果

一、RA早期患者未經刺激PBMC TLR mRNA表達

用相對定量2－ΔΔCt法計算 TLR mRNA 含量，將一例正常對照設定為1，具體結果見表2。

表2 RA早期患者PBMC TLRmRNA

二、經 50 ng/mL LPS刺激的 PBMC TLR4 mRNA變化

用相對定量2－ΔΔCt法計算TLR4 mRNA變化，將其未刺激對照設定為1。RA組經50 ng/mL LPS刺激后，TLR4 mRNA升高3．50倍(中位數)，而健康對照組下降到0．11倍(中位數)。

三、經50 ng/mL LPS刺激的CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率的變化

RA早期患者CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率與健康對照組相比，差異無統計學意義(P＞0．05，數據未顯示)。用LPS刺激單個核細胞，發現培養24 h后，RA患者和健康對照者CD14+單核細胞表面TLR4表達均下降，但RA患者下降更加顯著，48 h RA患者TLR4表達上升，而健康對照組TLR4表達持續下降，見圖1。

四、ELISA檢測PBMC經LPS刺激48 h的上清液 IL-6、TNFα 濃度

經50 ng/mL LPS刺激后，上清液IL-6濃度RA組上升了38．90倍，健康對照組上升了10．20倍;TNFα濃度RA組上升了54．80倍，健康對照組上升了26．80倍。PBMC與抗TLR4預先共育后，IL-6、TNFα濃度變化不顯著。見表3。

圖1 經LPS刺激的CD14+單核細胞TLR4+細胞頻率變化百分率

五、ELISA檢測PBMC經1 ng/mL BGN刺激48 h的上清液IL-6、TNFα濃度。

經1 ng/mL BGN刺激后，上清液IL-6濃度RA組上升了2．65倍，健康對照組上升了1．39倍;TNFα濃度RA組上升了5．76倍，健康對照組上升了1．39倍。PBMC與抗TLR2預先共育后，IL-6、TNFα濃度均下降。見表4。

表3 LPS刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα濃度

表4 BGN刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα濃度

討 論

RA是一種以慢性、對稱性多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現的自身免疫炎性疾病。目前其病因及發病機制不明，但一般認為是溶血性鏈球菌或其他細菌代謝產物、慢病毒或支原體的持續感染引起遺傳易感個體的自身免疫反應。

小鼠關節炎模型研究表明，起始階段通過TLR2活化促進血管的發生，便于炎癥細胞黏附與侵襲，導致關節軟骨和骨組織的破壞［3］，在發病后期，TLR4增加金屬蛋白酶介導的破壞作用和破骨細胞形成［4］，導致慢性破壞性關節炎［5］，并提示內源性TLR4配體在關節破壞階段發揮重要作用。Iwahashi等［6］用流式細胞術證實，RA 患者CD16+單核細胞高表達TLR2。本研究用實時熒光RT-PCR檢測RA早期患者PBMC TLR2 mRNA表達，也證實RA早期患者TLR2顯著增加，提示在人的RA早期，可能也是主要通過TLR2發揮疾病的始動作用。

本研究發現RA早期患者TLR4 mRNA降低，并且PBMC在未刺激的情況下產生的細胞因子IL-6、TNFα 反而比健康對照組低，而 IL-6、TNFα的濃度與RA病情嚴重性密切相關。PBMC產生細胞因子低的原因可能是RA早期產生炎癥因子功能較強的單核細胞向關節腔聚集引起炎癥反應。盡管RA患者早期PBMC TLR4 mRNA表達下降，但RA患者的PBMC對LPS的刺激反應性與健康對照組顯著不同，經LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA上升，而健康對照組顯著下降，可能的機制是RA患者單個核細胞對配體耐受性較強。用流式細胞術證實，CD14+單核細胞在LPS刺激24 h后，細胞表面TLR4表達下降，但RA患者下降更加顯著，在48 h RA組又上升到未刺激時的狀態，而健康對照組則持續下降，說明RA患者隨著TLR4 mRNA上升，細胞表面TLR4蛋白表達恢復。

Huang等［7］從RA患者關節滑液中分離的巨噬細胞與體內單核細胞誘導分化而來的巨噬細胞相比，對肽聚糖和LPS有更高的反應性。本研究用LPS、BGN刺激PBMC，都導致了 IL-6、TNFα 等炎性細胞因子的產生增加，但RA組上升的倍數明顯高于健康對照組，說明RA患者PBMC處于活化狀態。用抗體封閉單個核細胞相應的TLR后，可使細胞因子的產生大幅度下降。

業已證實，RA患者的關節中不僅存在著TLR2和TLR4識別的微生物來源的肽聚糖、雙鏈RNA等外源性TLR配體，還存在內源性TLR配體，如熱休克蛋白 96［8］、纖維蛋白原、透明質酸等［9］。這些證據表明RA早期階段，TLR可能通過識別外源性、內源性配體激活PBMC、滑膜成纖維細胞和巨噬細胞，上調前炎性細胞因子、趨化因子、組織破壞酶的表達，從而導致關節炎的發生。Sacre等［10］應用藥物選擇性抑制TLR信號途徑，能改善膠原誘導的鼠關節炎癥狀，也可以抑制炎性細胞因子在人RA組織中的產生。

本研究結果顯示，RA早期患者PBMC TLR2表達增加、TLR4下降，TLR4對其配體刺激有較高的反應性，產生更多的細胞因子，說明RA患者PBMC處于活化狀態，通過TLR受體啟動機體的炎癥反應，合成和釋放炎癥因子，最終導致關節組織和骨組織的破壞。細菌、病毒的感染通過單個核細胞TLR引起一系列炎癥反應可能是RA誘發因素。因此探討TLR對RA免疫學發病機制以及在此環節上尋求更有效的疾病干預靶點具有重要意義。

［1］Sorensen LK，Havemose-Poulsen A，Sonder SU．Blood cell gene expression profiling in subjects with aggressive periodontitis and chronic arthritis［J］．J Periodontol，2008，79(3):477-485．

［2］Huang Q，Ma Y，Adebayo A．Increased macrophage activation mediated through toll-like receptors in rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，2007，56(7):2192-2201．

［3］Saber T，Veale DJ，Balogh E，etal．Toll-like receptor 2 induced angiogenesis and invasion is mediated through the Tie2 signalling pathway in rheumatoid arthritis［J］．PLoSOne，2011，6(8):e23540．

［4］Abdollahi-Roodsaz S，Joosten LA，Helsen MM，etal．Shift from toll-like receptor2(TLR-2)toward TLR-4 dependency in the erosive stage of chronic streptococcal cell wall arthritis coincidentwith TLR-4-mediated interleukin-17 production［J］． Arthritis Rheum，2008，58(12):3753-3764．

［5］Grevers LC，de Vries TJ，Vogl T，et al．S100A8 enhances osteoclastic bone resorption in vitro through activation of Toll-like receptor 4:implications for bone destruction in murine antigen-induced arthritis［J］．Arthritis Rheum，2011，63(5):1365-1375．

［6］IwahashiM，Yamamura M，Aita T，etal．Expression of Toll-like receptor 2 on CD16+blood monocytes and synovial tissuemacrophages in rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，2004，50(5):1457-1467．

［7］Huang Q，Ma Y，Adebayo A，etal．Increasedmacrophage activation mediated through toll-like receptors in rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，2007，56(7):2192-2201．

［8］Huang QQ，Sobkoviak R，Jockheck-Clark AR，etal．Heat shock protein 96 is elevated in rheumatoid arthritis and activatesmacrophages primarilty via TLR2 signaling［J］．J Immunol，2009，182(8):4965-4973．

［9］Ospelt C，Brentano F，Rengel Y，et al．Overexpression of toll-like receptor 3 and 4 in synovial tissue from patients with early rheumatoid arthritis:toll-like receptor expression in early and longstanding arthritis［J］．Arthritis Rheum，2008，58(12):3684-3692．

［10］Sacre S，Medghalchi M，Gregory B，et al．Fluoxetine and citalopram exhibit potentantiinflammatory activity in human and murine models of rheumatoid arthritis and inhibit toll-like receptors［J］．Arthritis Rheum，2010，62(3):683-693．

Study on the expression and significance of Toll-like receptor 2 and 4 of peripheralblood mononuclear cells in patients w ith early-stage rheumatoid arthritis

QIAN Lei1，WANG Xiaoying2，Lü Lijun2，CHEN Dexun1．(1．

Departmert of Clinical Laboratory，Binhai County People's Hospital，Jiangsu Binhai 224500，China;2．Department of Immunology，Nantong University，Jiangsu Nantong 226001，China)

Objective To investigate the effects of Toll-like receptor(TLR)2 and TLR4 of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in patients with early-stage rheumatoid arthritis(RA)and the responsiveness of TLR4 to lipopolysaccharide(LPS)and TLR2 to biglycan(BGN)．M ethods The expressions of TLR4+/CD14+monocytes，TLR2 mRNA，TLR4 mRNA and cytokines of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor alpha(TNFα)in supernatantswere analyzed by flow cytometry，real-time fluorescence quantitation reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)respectively in PBMC before and after stimulation．Results The TLR2 mRNA in PBMC of RA patientswere significantly higher than those of healthy controls(P ＜0．01)．The TLR4 mRNA of RA patients were significantly lower than those of healthy control．LPS increased TLR4 mRNA of RA patients(3．50-fold)and decreased TLR4 mRNA of healthy controls(0．11-fold)．LPS and BGN increased cytokines'production in all groups，while the increased folds of IL-6 and TNFα in PBMC from RA patients were significantly higher than the cells from healthy controls．Conclusions TLR2 and TLR4 of PBMC display important roles in the development of early-stage RA．

Toll-like receptor 2;Toll-like receptor 4;Peripheral blood mononuclear cell;Rheumatoid arthritis

2011-06-05)

(本文編輯:姜 敏)

1673-8640(2012)08-0659-04

R446．62

A

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)

錢 雷，男，1970年生，碩士，副主任技師，主要從事自身免疫性疾病研究。通訊作者:汪曉鶯，聯系電話:0515-84234889。