EGFR蛋白在食管鱗癌中的表達及其臨床意義

吳金訓，余英豪，劉 偉

(中國人民解放軍南京軍區福州總醫院病理科，福州350025)

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發生率和病死率居第4位[1]。目前食管癌的治療仍以手術治療為主，放療、化療為輔，70%的患者確診時已處于臨床中晚期，化療效果不明顯，5年生存率不足20%，復發和轉移是導致患者死亡的主要原因，尋求新的治療靶點，制訂新的化療方案是臨床迫切需要解決的問題[2]。鑒于目前國內尚未見食管癌中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白表達的大宗病例研究，該項研究采用免疫組織化學法檢測食管鱗癌組織中EGFR的表達，探討EGFR蛋白表達與食管癌發生、發展、浸潤轉移等臨床病理特征的關系，以期為食管癌患者靶向治療的深入研究提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2004年1月至2010年6月在南京軍區福州總醫院手術切除的食管鱗癌標本1300例，選擇其中臨床資料完整的1034例進行研究，其中男778例，女256例，年齡24～87(平均56.9)歲。所有病例術前均未行放療、化療。肉眼分型為蕈傘型、潰瘍型、髓質型、縮窄型。食管鱗癌TNM分期采用AJCC標準(2002)[3]。

1.2實驗儀器與試劑試劑購自福州邁新生物技術開發公司，一抗為鼠抗人單克隆抗體EGFR。試劑盒選用EliVisionTM plus試劑盒;石蠟切片機(LEICA RM2245);顯微鏡(OLYMPUS BX51);電熱恒溫干燥箱(上海-恒科技有限公司)。所有標記均設陽性對照并用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3方法 手術標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續切片，分別進行HE和免疫組織化學染色。采用EliVisionTM plus方法進行免疫組織化學染色的主要步驟:石蠟切片、脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(phosplate buffer saline，PBS)沖洗3次，每次沖洗3 min;胃酶抗原修復，37℃ 10 min;加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加第一抗體，室溫下孵育60 min;PBS沖洗3×5 min;室溫下孵育20 min;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加酶標抗鼠聚合物，室溫下孵育30 min;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加新配制的3，3'-二氨基聯苯胺顯色液，自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍;梯度乙醇脫水干燥，中性樹脂封片。

1.4EGFR過表達的判斷標準 腫瘤細胞不著色或＜10%的腫瘤細胞著色為陰性，≥10%的腫瘤細胞著色為陽性，并根據腫瘤陽性細胞數所占比例分為10%～25%為弱陽性(+)，＞25%為強陽性(++)[2]。

1.5統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1EGFR蛋白在食管鱗癌中的表達 食管鱗癌組織中EGFR陽性表達定位于胞膜，少量定位于胞質，其表達呈明顯的異質性(圖 1)。癌旁(距癌灶＞2 cm)非腫瘤性食管黏膜未見EGFR過表達(圖2)。

2.2EGFR蛋白表達與食管鱗癌患者臨床及病理參數的關系 在1034例食管鱗癌組織中EGFR過表達率高達74.9%(774/1034)，陰性表達260例。EGFR蛋白過表達陽性率與患者性別，年齡，腫瘤大小，肉眼分型，TNM分期，浸潤深度，淋巴結轉移及遠處轉移等臨床及病理參數無統計學意義(P＞0.05)，而高、中分化胃癌中EGFR的表達陽性率顯著高于低、未分化胃癌(P ＜0.05)(表1)。

圖1 EGFR蛋白在食管鱗癌中過表達(×100)

圖2 癌旁非腫瘤性食管黏膜EGFR陰性(×100)

表1 EGFR蛋白過表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系 [例(%)]

3 討論

EGFR是原癌基因 C-erbB-1的表達產物，是EGFR家族的成員之一，即ErbB1。EGFR基因定位于人第 7號染色體的短臂(7p12.3～p12.1)，長約118 kb，含有28個外顯子，編碼一個相對分子質量為170 ×103的糖蛋白[3]。劉偉等[4]在前期研究中發現，EGFR在胃癌中的過表達率為17.03%，且其表達與浸潤深度、組織類型、分化程度、淋巴結轉移等密切相關(P＜0.05)，EGFR過表達可以作為評價胃癌惡性生物學行為和預后的參考指標。研究發現，胃癌、肝癌、結直腸癌、肺癌以及乳腺癌中均存在EGFR蛋白過表達，且與腫瘤細胞的增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉移等相關[5-6]。

該項研究結果顯示，1034例食管鱗癌EGFR過表達率為74.9%(774/1034)，與文獻報道一致[7-9]。關于EGFR蛋白過表達與食管鱗癌患者的臨床參數及預后的相關性尚有爭議。李洪勝等[10]觀察42例食管癌，局部淋巴結轉移者的EGFR陽性率高于無局部淋巴結轉移者(56.52%vs 26.32%，P ＜0.05);遠處轉移者EGFR陽性率高于無遠處轉移者(47.62%vs 27.08%，P ＜0.05)。Wang 等[11]報道 103 例食管及與胃交界處腺癌，EGFR蛋白過表達率為32%(33/103)，EGFR蛋白過表達與病理分期、淋巴結轉移以及TNM分期有關，而與腫瘤分化無關，且具有EGFR過表達患者的預后較差。然而，有些學者認為EGFR蛋白過表達與患者的臨床參數及預后無明顯相關性[12-13]。該項研究中EGFR蛋白過表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、肉眼分型、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移等臨床病理參數均無相關性(P＞0.05)，而高、中分化胃癌中EGFR的表達顯著高于低、未分化胃癌(P＜0.05)，這種差異可能與樣本量大小不一及陽性判斷標準不同有關。關于EGFR與食管癌患者的臨床病理參數及預后的相關性尚需多中心大樣本及標準化的免疫組織化學檢測進一步證實。

目前，關于EGFR與腫瘤靶向治療的研究多數集中于非小細胞肺癌，以 EGFR酪氨酸激酶抑制劑為靶點的腫瘤分子靶向治療研究，成為腫瘤治療研究的熱點。在非小細胞肺癌中EGFR的突變位點主要位于外顯子18、19、20及外顯子21上，占總突變的95%以上[14-15]。研究表明，EGFR基因酪氨酸激酶ATP結合域的體細胞突變及擴增與非小細胞肺癌患者對酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼及抗EGFR單克隆抗體西妥昔單克隆抗體治療敏感性密切相關。在EGFR突變患者中應用吉非替尼及西妥昔單克隆抗體有效率可達80%以上，而EGFR野生型患者的有效率在10%以下[16-17];具有EGFR基因擴增患者有效率達40%以上，而EGFR基因無擴增患者有效率在10%以下[18]。EGFR在食管癌中的過表達，為其靶向治療提供新的治療靶點，EGFR靶向藥物在食管鱗癌中的使用目前尚無大規模的臨床試驗報道，得出的結論也不一致。Ferry等[19]采用吉非替尼治療進展期食管腺癌27例，研究顯示單藥吉非替尼二線治療食管癌，特別是男性、腺癌、低表達EGFR的病例并未顯示出明顯的優勢，而食管鱗癌、女性、過表達EGFR的的病例的治療效果較傳統化療有較明顯的優勢。Janmaat等[20]Ⅱ期臨床研究二線治療食管癌的研究發現，吉非替尼對EGFR過表達的女性、鱗癌患者的有效率較高。雖然早期的臨床試驗應用針對EGFR的靶向藥物治療食管癌已顯示出一定的療效，但仍有很大部分患者不能從靶向治療中獲益。研究EGFR蛋白表達、基因擴增及基因突變狀態對研究EGFR基因與靶向治療的關系及篩選對EGFR靶向治療敏感的患者都具有重要意義。

目前，關于食管癌中EGFR基因擴增率及與蛋白表達是否具有一致性尚存在爭議。食管癌中EGFR是否存在基因突變，突變位點、突變率如何，對于具有基因突變或擴增的患者應用靶向藥物的療效如何等都需要進一步的基礎及臨床試驗研究。該項本研究的后續研究中，將選取部分EGFR蛋白過表達的病例，應用熒光原位雜交技術和直接測序法分別檢測EGFR基因擴增和基因突變情況，進一步探索食管癌EGFR過表達的機制，為臨床選取針對EGFR抗體的靶向藥物提供初步的理論依據。

[1]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009[J].CA Cancer J Clin，2009，59(4):225-249.

[2]Racette AL，Miller RT.Esophageal carcinoma:matching patients with treatment methods[J].JAAPA，2011，24(1):28-31.

[3]Hofstetter W，Correa AM，Bekele N，et al.Proposed modification of nodal status in AJCC esophageal cancer staging system[J].Ann Thorac Surg，2007，84(2):365-373.

[4]劉偉，余英豪，陳娟，等.EGFR在中國胃癌患者中的表達及其臨床意義[J].世界華人消化雜志，2010，18(25):2648-2653.

[5]Ciardiello F，Tortora G.EGFR antagonists in cancer treatment[J].N Engl J Med，2008，358(15):1160-1174.

[6]Ruppert AM，Wislez M，Poulot V，et al.A simple view on lung cancer biology:The EGFR pathway[J].Rev Mal Respir，2011，28(4):565-577.

[7]Rocha-Lima CM，Soares HP，Raez LE，et al.EGFR targeting of solid tumors[J].Cancer Control，2007，14(3):295-3.4.

[8]付建華，楊達寬，黃云超，等.EGFR和 E-cadherin在食管癌組織中的表達及兩者的相關性[J].癌癥，2005，24(2):241-245.

[9]Hanawa M，Suzuki S，Dobashi Y，et al.EGFR protein overexpression and gene amplification in squamous cell carcinomas of the esophagus[J].Int J Cancer，2006，118(5):1173-1180.

[10]李洪勝，王遠東，譚小軍，等.EGFR及 E-cadherin表達與食管癌的關系[J].腫瘤研究與臨床，2005，17(3):175-177.

[11]Wang KL，Wu TT，Choi IS，et al.Expression of epidermal growth factor receptor in esophageal and esophagogastric junction adenocarcinomas association with poor outcome[J].Cancer，2007，109(4):658-667.

[12]Gotoh M，Takiuchi H，Kawabe S，et al.Epidermal growth factor receptor is a possible predictor of sensitivity to chemoradiotherapy in the primary lesion of esophageal squamous cell carcinoma[J].Jpn J Clin Oncol，2007，37(9):652-657.

[13]Kii T，Takiuchi H，Kawabe S，et al.Evaluation of prognostic factors of esophageal squamous cell carcinoma(stageⅡ～Ⅲ)after concurrent chemoradiotherapy using biopsy specimens[J].Jpn J Clin Oncol，2007，37(8):583-589.

[14]Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2006，12(13):3915-3921.

[15]Tiseo M，Rossi G，Capelletti M，et al.Predictors of gefitinib outcomes in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC):study of a comprehensive panel of molecular markers[J].Lung Cancer，2010，67(3):355-360.

[16]Miller VA，Riely GI，Zakowski MF.Molecular characteristics of bronchioloalveolar carcinoma and adenocarcinoma，bronchioloalveolar carcinoma subtype，predict response to erlotinib[J].J Clin Oncol，2008，26(9):1472-1478.

[17]Cappuzzo F，Ligorio C，J?nne PA，et al.Prospective study of gefitinib in epidermal growth factor receptor fluorescence in situ hybridization positive/phospho-Akt-positive or never smoker patients with advanced nonsmall-cell lung cancer:the ONCOBELL tria1[J].J Clin Oncol，2007，25(16):2248-2255.

[18]Pinto C，Di Fabio F，Siena S，et al.Phase Ⅱ study of cetuximab in combination with FOLFIRI in patients with untreated advanced gastric or gastroesophageal junction adenocarcinoma(FOLCETUX study)[J].Ann Oncol，2007，18(3):510-517.

[19]Ferry DR，Anderson M，Beddard K，et al.A phase Ⅱ study of gefitinib monotherapy in advanced esophageal adenocarcinoma:evidence of gene expression，cellular，and clinical response[J].Clin Cancer Res，2007，13(19):5869-5875.

[20]Janmaat ML，Gallegos-Ruiz MI，Rodriguez JA，et al.Predictive factors for outcome in a phaseⅡstudy of gefitinib in second-line treatment of advanced esophageal cancer patients[J].J Clin Oncol，2006，24(10):1612-1619.