靶向乙酰肝素酶siRNA對大腸癌細胞惡性生物學行為的影響

張子華,吳海峰,楊鋒榮,胡 浩,李恒建,白 霞

(江蘇省吳江市中醫醫院普外科,江蘇吳江,215221)

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一,腫瘤轉移是導致病死的主要原因,腫瘤浸潤和轉移是臨床治療失敗的主要因素。隨著對腫瘤侵襲轉移機制的認識,發現有很多生物活性分子參與腫瘤的轉移與浸潤,其中主要包括乙酰肝素酶,該物質是一種內源性的葡萄糖酸酯酶,能夠水解細胞表面、細胞外基質的乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的多糖側鏈,促進腫瘤細胞侵人基質和血管壁[1],因此將乙酰肝素酶作為靶向治療點成為研究的熱點,國內外關于乙酰肝素酶的研究很多,但關于其與大腸癌的相關研究報道甚少,本文采用基因干擾的方法,研究乙酰肝素酶siRNA在大腸癌中作用,為大腸癌的臨床治療,特別是在基因治療方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SW620細胞在37℃,5%CO2條件下傳代培養。胰酶及噻唑藍(MTF),佛波酯,二甲基亞砜(DMSO),Tr-answellTM培養板。IGO150CO2培養箱,Leica熒光倒置顯微鏡。SPF級裸小鼠20只購買自南京醫科大學動物中心。Trizo總RNA提取試劑盒購自sigma公司。乙酰肝素酶siRNA購自日本 TaKaRa公司。定量實時 PCR引物購自日本Life Science公司。Hpa(H-80)兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,即用型SP-9000檢測試劑盒以及 DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 轉染:選取對數期生長的大腸SW620癌細胞,胰酶消化法收集細胞,實驗組(n=6)使用轉染試劑將siRNA經逆轉染法[2]導入大腸SW620癌細胞,將細胞懸浮液接種在24孔培養板中,21 h后待細胞融合70%左右時,用構建的乙酰肝素酶siRNA轉染到大腸SW620癌細胞,48 h后用熒光顯微檢測其轉染率。對照組的癌細胞(n=6)用非特異性的siRNA處理。

1.2.2 熒光顯微鏡檢測細胞轉染率:2組細胞在轉染48 h后,在熒光顯微鏡觀察其轉染率。在200倍的顯微鏡下隨機選取6個視野計算轉染率。

1.2.3 PCR擴增:按照說明書,利用Trizo總RNA提取試劑盒對2組細胞進行總RNA提取,逆轉錄成模板cDNA,以該cDNA為模板對乙酰肝素酶基因進行實時定量PCR擴增。反應條件為:95℃預變性5 min,75℃,30s,復性。57℃,34 s,擴增,共40個循環。實驗數據使用7500system軟件進行統計分析。

1.2.4 乙酰肝素酶蛋白檢測:采用細胞免疫組織化學染色的方法對兩組細胞進行乙酰肝素酶蛋白的檢測[3],細胞培養在24孔板中,待細胞出現貼壁,吸出培養基,用多聚甲醛固定癌細胞15 min,用PBS浸泡3次,每次5 min。采用免疫組織化學ABC法染色,加入過氧化物酶,封閉10 min,PBS浸泡3次,再分別加入一抗和二抗,洗脫,顯色,顯微鏡下觀察顯色,加雙蒸水終止反應。

1.2.5 細胞侵襲能力:采用24孔版凝膠侵襲小室檢測,上下室間濾膜的孔徑為10 μ m,可以模擬癌細胞的侵襲內環境。取實驗組和對照組細胞各6 孔板 200 μL 加入上室,1000 μL 的培養液加入到下室,37℃,5%CO2條件下傳代培養48 h后,4%多聚甲醛固定,染色,顯微鏡下隨機6個視野觀察下室內的細胞數。

2 結 果

2.1 轉染率

分別用靶向乙酰肝素酶siRNA和非特異性的siRNA轉染實驗組和對照組,經顯微鏡下發現,2組的轉染率無顯著差異,見表1。

表1 2組的細胞的轉染率()

表1 2組的細胞的轉染率()

組別 n 轉染細胞數(個) 轉染率(%)實驗組 6 103.5±11.3 62.8±6.3對照組 6 98.6±10.6 59.9±5.4

2.2 PCR檢測乙酰肝素酶mRNA的表達

實驗組的乙酰肝素酶mRNA的表達水平(0.3±0.1)顯著低于對照組(2.3±1.5)(P<0.01)。

2.3 免疫組化檢測乙酰肝素酶蛋白表達情況

結果顯示實驗組的乙酰肝素酶蛋白含量的表達水平(3.2±2.4)顯著低于對照組(13.1±10.4)(P<0.05)。

2.4 細胞侵襲

通過侵襲實驗檢測細胞侵襲力,對照組的侵襲細胞數為(125.6±10.2)個顯著多于實驗組(21.3±5.8)個,差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

乙酰肝素酶于1975年被Ogren和Lindahl發現,經過幾十年的深入研究,人們對其有了全面的了解,尤其是其與腫瘤浸潤侵襲的關系引起科學工作者的廣泛的關注,很多學者已經證實乙酰肝素酶是惡性腫瘤的重要的功能酶之一,乙酰肝素酶在卵巢癌組織的異常表達并參與卵巢癌細胞的生長、侵襲、轉移和血管的生成[1]。乙酰肝素酶基因轉染的方法也證實乙酰肝素酶在腫瘤侵襲轉移中作用,提示乙酰肝素酶可作為治療癌癥轉移的靶點。

有研究報道乙酰肝素酶在膀胱移行細胞癌組織中與膀胱移行細胞癌浸潤、轉移相關[4],在其他惡性腫瘤中亦有表達[5-6]。但在大腸癌研究中有關乙酰肝素酶的報道甚少,本課題研究對2組大腸癌細胞分別轉染靶向的siRNA和非特異性的siRNA,發現其轉染率無顯著差異,推測是由于大腸癌細胞對于兩種引物無顯著的選擇性,均可部分透過細胞膜達到轉染的目的,與趙玲等[1]的研究報道一致。

另外通過RT-PCR檢測乙酰肝素酶mRNA表達,并利用免疫組化檢測乙酰肝素酶蛋白表達情況,發現實驗組的乙酰肝素酶mRNA和蛋白含量均顯著低于對照組,說明采用RNA干擾的方法,有效地抑制了乙酰肝素酶基因的轉錄和翻譯,可能是由于siRNA能抑制乙酰肝素酶的細胞周期,逆轉上皮細胞向間質細胞的轉化。有研究發現[7]通過對胃癌細胞的乙酰肝素酶基因進行RNA干擾,可降低其mRNA及其蛋白含量,支持本研究結果。

本研究接著又做了侵襲實驗來檢測細胞侵襲力,結果顯示實驗組的細胞侵襲能力也顯著低于對照組,我們推測可能是由于采用靶向乙酰肝素酶的siRNA能抑制或者降低乙酰肝素酶的水解多糖側鏈功能,使其參與腫瘤細胞浸潤轉移的能力下降所致,研究發現應用抑制乙酰肝素酶藥物后,腫瘤的浸潤和轉移能力都顯著下降[8],劉玉設計構建的雙基因shRNA基因真核表達載體,以脂質體介導的方法轉染人卵巢癌細胞,可顯著抑制卵巢癌細胞乙酰肝素酶基因和蛋白的表達。降低細胞侵襲能力[9]。應用乙酰肝素酶的反義核苷酸[10]與使用乙酰肝素酶抑制劑降低腫瘤細胞的轉移能力相一致[11]。

[1]趙玲,楊鷹.沉默乙酰肝素酶基因對人卵巢癌SKOV3細胞增殖、侵襲能力的影響[J].第三軍醫大學學報,2011,33(22):2361.

[2]Ovcharenko D,Jarvis R,Hunicke-Smith S,et al.Highthrouput RNAi screening in vitro:from cell lines to primary cells[J].RNA,2005,11(6):985.

[3]王丹,李彥,孫桂媛,等.兔角膜上皮細胞體外原代培養和鑒定[J].河北醫科大學學報,2011,32(10):1117.

[4]陳芳,李麗.乙酰肝素酶、MM P-9在膀胱移行細胞癌侵襲轉移中的表達相關性及臨床意義[J].中國醫藥導報,2012,9(1):22.

[5]Fryer J F,Delwart E,Hecht F M,et al.Frequent detection of the parvoviruses,PARV4 and PARV5,in plasma from blood donors and symptomatic individuals[J].Transfusion.2007,47(6):1054.

[6]Heldt C L,Gurgel P V,Jaykus L A,et al.Identification of trimeric peptides that bind porcine parvovirus from mixtures containing human blood plasma[J].Biotechnol.Prog,2008,24(3):554.

[7]馬秀梅,王栓柱,于宏,等.沉默乙酰肝素酶對人胃癌細胞侵襲遷移能力的影響[J].腫瘤,2009,29(10):924.

[8]王健.乙酰肝素酶在膽管癌組織中的表達及意義[D].中國醫科大學,2010.

[9]劉玉,辛曉燕,毛敬,等.雙基因shRNA干擾乙酰肝素酶在卵巢癌細胞中表達的實驗研究[J].腫瘤,2006,26(11):984.

[10]Gao J,Su L,Qin R,et al.Transfection of antisense oligodeoxynucleotide inhibits heparanase gene expression and invasive ability of human pancreatic cancer cell in vitro[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006,26(1):72.

[11]Zhao H,Liu H,Chen Y,et al.Oligomannurarate sulfate,a novel heparanase inhibitor simultaneously targeting basic fibroblast growth factor,combats tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Res,2006,66(17):8779.