雙特異性單抗對胃腸癌的體內殺傷作用

劉洪一,李 榮,劉巨超,李 力,梁文濤,鐘 苑,徐迎新

(中國人民解放軍總醫院,1.腫瘤外科;2.普通外科研究所,北京,100853)

對于胃腸癌的治療,除手術、化療及放療等治療之外,生物治療尤其是應用CIK細胞進行腫瘤的過繼免疫治療是近年來研究較多的一種治療手段[1],并已廣泛應用于臨床。但CIK細胞對于腫瘤的治療缺乏靶向性,CIK細胞很難在腫瘤周圍得到很好的濃聚。而目前有許多雙特異性抗體在體外實驗取得了良好的結果,并且部分雙特異性抗體的研究已進入臨床實驗階段[2],抗CD3抗CEA的雙特異性抗體就是其中研究較多的抗體之一[3],它一方面可以激活細胞毒T淋巴細胞,另一方面可以使免疫細胞在腫瘤局部聚集,更好地殺傷腫瘤細胞。本研究在前人研究的基礎上,進一步探討了抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體介導的CIK細胞對胃腸癌的體內殺傷作用,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體(BsAb)購自北京安渡符基因工程技術有限公司;人胃低分化腺癌BGC823細胞、人結腸中分化腺癌SW1116細胞,由本院普通外科研究所提供。健康人外周血由本院輸血科提供,近期無感染病史及疫苗接種病史,乙肝、丙肝、梅毒、AIDS檢測陰性。裸小鼠50只,購自本院實驗動物中心,均為雌性,鼠齡6周,體質量17～20 g。于本院實驗動物中心SPF級無菌飼養。其他常規試劑均為進口或國產分析純化。

1.2 CIK細胞的制備與鑒定

取人外周血25 mL與生理鹽水等體積混勻,然后緩慢的鋪在等體積的分離液上,以2000 r/min離心,20 min;收集白膜層,用生理鹽水洗滌1～2次,2500 r/min離心,10 min;3 h后收集未貼壁PBMC細胞,用KBM-551培養基10 mL重懸,移至75 cm2T型培養瓶中;0時刻加入rh-IFN-r 1000 U/mL終濃度;37℃,5%CO2,飽和濕度培養過夜;加入 CD3McAb 2 μg/mL終濃度,IL-2500 U/mL終濃度;隔日加入新鮮培養基、IL-2;培養過程中經常觀察細胞狀態以備后續實驗用。在CIK細胞培養成熟后,應用流式細胞儀進行CD3、CD4、CD8和CD56表達的鑒定。

1.3 動物模型的建立

利用T細胞免疫缺陷裸鼠,分別以人胃低分化腺癌BGC823細胞及人結腸中分化腺癌SW1116細胞制備小鼠皮下荷瘤模型。分別取對數生長期上述細胞,0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液,胎盤藍實驗證實細胞活力≥95%;用6號針頭注射器抽取0.2 mL瘤細胞懸液(含活細胞5×106個)接種于裸鼠左腋下皮下,無菌環境下飼養;致瘤2周后,腫瘤生長約6 mm,剔除腫瘤過大、過小或棘突明顯的裸鼠。

1.4 體內抑瘤試驗

胃癌及結腸癌組分別隨機分成3組。對照組(n=5),尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL/只,1次/3 d;CIK組(n=5),尾靜脈注射單純人CIK細胞0.2 mL/只(培養14 d左右,含活細胞 1×107個),1次/3 d;CIK+雙抗組(n=5),尾靜脈注射人CIK細胞和抗CEA抗CD3雙特異性單鏈抗體(1×107個CIK 細胞與10 μg抗體預混合30 min后洗脫),1次/3 d;連續治療 6次;每 3 d以游標卡尺測量腫瘤最大徑(a)和最小徑(b),按公式計算腫瘤體積:V=ab2/2;治療6次后,觀察3 d處死裸鼠,取出腫瘤組織稱重。計算公式抑瘤率:抑瘤率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

圖1 流式細胞結果

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測結果

FMC結果顯示:PBMC細胞經過10 d左右的培養后,CD3、CD4、CD8和 CD56的表達率分別為95.78%、29.36%、72.82%和53.32%,確定為CIK細胞[4],見圖1。

2.2 裸鼠動物模型

利用T細胞免疫缺陷裸鼠,以人胃低分化腺癌BGC823細胞及人結腸中分化腺癌SW1116細胞分別制備裸鼠皮下荷瘤模型。腫瘤懸液注射于裸鼠左側腋下2周后,可觀察到腫瘤生長,游標卡尺測量最大直徑為0.5～0.6 cm,成瘤率100%。

2.3 抑瘤實驗

胃癌及結腸癌的對照組腫瘤體積均持續增大,CIK組腫瘤體積均增長緩慢,2組間差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01);CIK+雙抗組腫瘤生長均明顯受到抑制,與對照組及CIK組之間差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01),見圖2、圖3。治療后3 d將裸鼠頸椎脫臼處死,剝離腫瘤塊、稱重,計算腫瘤抑瘤率,見表 1、表2;CIK組和CIK+雙抗組均可抑制腫瘤生長,胃癌的抑瘤率分別為29.90%和44.33%,瘤體積和瘤重和對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01);結腸癌的抑瘤率分別為14.93%和38.81%,瘤體積和瘤重和對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。CIK組和CIK+雙抗組比較,胃癌及結腸癌的瘤體積、瘤重間的差異均有統計學意義(P<0.05)。表明CIK細胞本身可以抑制腫瘤細胞的生長,在加入抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體后抑瘤作用明顯增強。

表1 胃癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

表1 胃癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

與對照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與CIK組比較,#P<0.05

組別 n 瘤體積(cm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%)對照組 5 0.88±0.14 0.97±0.16 -CIK組 5 0.64±0.12＊ 0.68±0.08＊＊ 29.90 CIK+雙抗組 5 0.42±0.09＊＊# 0.54±0.05＊＊# 44.33

表2 結腸癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

表2 結腸癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

與對照組比較,＊＊P<0.01;與CIK組比較,#P<0.05,##P<0.01

組別 n 瘤體積(cm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%)對照組 5 0.74±0.09 0.67±0.15 -CIK組 5 0.56±0.07＊＊ 0.57±0.09 14.93 CIK+雙抗組 5 0.39±0.06＊＊## 0.41±0.08＊＊# 38.81

圖2 胃癌腫瘤生長曲線

圖3 結腸癌腫瘤生長曲線

3 討 論

據2002年世界衛生組織統計,中國人胃癌的總人數占全世界的40%以上,而且胃癌相關死亡率處于第2位,僅次于肺癌[5]。2007年,全球結直腸癌新病例接近120萬,死亡63萬[6],據我國統計資料估計,我國2005年結直腸癌發病數和死亡數分別達17.2萬和9.9萬,已超過美國[7]。對于胃腸癌經傳統的手術、化療及放療等治療后,5年生存率仍不理想。因此,探索新的、有效的胃癌治療方法勢在必行。過繼性細胞免疫治療(ACI)是通過輸注免疫活性細胞增強腫瘤患者的免疫功能達到抗腫瘤的效果。其中以細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)目前應用較為廣泛[8]。CIK細胞作為腫瘤過繼免疫治療的一個新型免疫活性細胞,是近年來研究較多的一種生物治療手段。但是,研究同時發現CIK細胞在體外實驗中表現出的殺傷腫瘤細胞的活性,應用于體內效果卻往往差強人意。因此,如何使CIK細胞在體內識別并到達靶細胞,從而發揮殺傷作用,是迫切需要解決的問題,也是提高腫瘤生物治療療效的關鍵。

目前惡性腫瘤的靶向治療備受矚目,已有大量的靶向藥物應用于臨床。而目前的靶向藥物大都以腫瘤細胞特異性抗原為靶抗原,直接作用于靶點,抑制腫瘤的生長或者阻斷細胞信號傳導通路[9]。因此要求靶抗原除了具有腫瘤組織特異性之外,還要求靶抗原在腫瘤的生長環節中具有重要地位。而已知的大多數腫瘤特異性抗原均不具有這樣的組織特異性,因此靶向藥物的研制也受到巨大的阻礙[10]。可激活細胞毒T淋巴細胞并使其在腫瘤局部聚集的抗CD3抗腫瘤特異性抗原的雙特異性抗體備受研究者矚目。

為了觀察雙特異性單鏈抗體介導的CIK細胞對胃癌的體內殺傷作用,本研究制備人源胃癌及結腸癌的荷瘤裸鼠模型。本研究結果顯示,對照組腫瘤體積持續增大,CIK組腫瘤體積增長緩慢,CIK+雙抗組腫瘤生長明顯受到抑制。CIK細胞本身可以抑制腫瘤細胞的生長,在加入抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體后抑瘤作用明顯增強。其原因可能是CIK細胞結合了雙特異性抗體后,具有更好的腫瘤靶向作用。同時,雙特異性抗體除了可以結合CIK細胞外,還可以結合任何表達CD3的免疫細胞,因此在具有正常免疫系統的體內試驗時,可能會收到意想不到的良好效果,但結果有待于進一步研究。

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